一株除臭细菌的筛选及鉴定

2023-07-04 04:46:50吴翔余洋谢丽源
安徽农业科学 2023年6期
关键词:筛选鉴定

吴翔 余洋 谢丽源

摘要[目的]筛选获得分类地位明确、具有较好除臭效果的微生物菌株。[方法]通过平板涂布法从鸡粪发酵料中筛选具有除臭效果的菌株,并检测各菌株对鸡粪中氨气和硫化氢的降解率。通过表型特征、生理生化特征和遗传特征等多相分析来确定目的菌株的分类地位。[结果]筛选获得一株除臭细菌3-1,对氨气和硫化氢的降解率分别达到了63.08%和62.80%。鉴定结果表明,细菌3-1为原磷谷氨酸杆菌(Glutamicibacter protophormiae),在GenBank核酸登录号为OM816730。[结论]菌株3-1在无害化处理畜禽粪污方面具有一定的应用前景。

关键词 除臭细菌;筛选;鉴定

中图分类号 X172 文献标识码 A 文章编号 0517-6611(2023)06-0058-03

doi:10.3969/j.issn.0517-6611.2023.06.016

Screening and Identification of a Deodorant Bacterial Strain

WU Xiang1,2,YU Yang1,2,XIE Li-yuan1,2

(1. Sichuan Institute of Edible Fungi,Chengdu,Sichuan 610066;2. National Observing and Experimental Station of Agricultural Microbiology in Xindu,Chengdu,Sichuan 610066)

Abstract [Objective] To screen microbial strains with clear classification status and good deodorization effect.[Method]Strains with deodorization effect were screened from chicken manure fermentation materials by plate coating method, and the degradation rates of ammonia and hydrogen sulfide in chicken manure were tested.The taxonomic status of the target strain was determined by multiphase analysis of phenotypic characteristics, physiological and biochemical characteristics and genetic characteristics.[Result] The strain 3-1 possessing deodorizing functions was isolated,the amount of NH3 and H2S removed were 63.08% and 62.80% .The identification results showed that bacteria 3-1 was Glutamicobacter prototropiae, and the nucleic acid registration number in GenBank was OM816730.[Conclusion] The isolated strain 3-1 have great potential for the harmless treatment of livestock manure.

Key words Deodorant bacterial;Screening;Identification

随着经济发展,人民生活水平的提高,对肉、蛋、奶等产品的需求越来越大,促进了畜禽养殖业的快速发展。而畜禽养殖业的发展必然增加畜禽粪污产生的量,给环境带来新的压力。其中畜禽粪便中含有的大量蛋白质、氨基酸等营养物质被分解为NH3、H2S等恶臭气体[1],这些气体会引起周围强烈的刺激性,损害吸入群体的人身健康。目前對这些恶臭气体主要的处理方法有物理法、化学法和生物法[2-6],而生物法主要通过微生物降解、转化恶臭成分,具有成本低、不易产生二次污染等优点,因此是解决恶臭气体重要的研究方向。该研究从鸡粪发酵物中筛选降解NH3和H2S的微生物菌株,为后续研发除臭剂打下基础。

1 材料与方法

1.1 培养基

含氮富集液体培养基[7]:蔗糖25 g,NH4NO3 2 g,KH2PO4 2 g,NaCl 2 g,FeSO4 0.1 g,CaCl2 0.5 g,ZnSO4 0.05 g,MgSO4·7H2O 0.5 g,蒸馏水950 mL,灭菌后的鸡粪浸出液50 mL,pH 7.5~8.0。

LB培养基:胰蛋白胨 10 g,酵母提取物 5 g,NaCl 10 g,琼脂粉18 g,蒸馏水1 000 mL,pH 7.4。

产气检测培养基[8]:蔗糖2 g,NaCl 10 g,蛋白胨10 g,酵母浸出粉5 g,琼脂粉18 g,蒸馏水1 000 mL,pH 6.5~7.0。

1.2 样品采集及处理

在成都市大邑县、邛崃市采集鸡粪发酵物共计5个,称取样品各5 g分别置于富氮液体培养基中进行富集培养,放入30 ℃、120 r/min摇床振荡,3 d后在转接到新鲜的培养液中培养,连续转接3次。

1.3 菌株筛选

将富集后的培养液进行梯度稀释,选取适宜稀释度的稀释液0.1 mL,采用平板涂布法涂布于LB培养基上,于30 ℃的恒温培养箱倒置培养,待菌长出后将纯化后的单个菌株接种到产气培养基,利用石蕊试纸和醋酸铅试纸检测各菌株的产气情况,菌株生长过程中产生NH3红色石蕊试纸将变为蓝色,产生H2S气体醋酸铅试纸将变为黑色[9]。参照李玥等[8]的方法,再次检测2种气体产气试验都不变色菌株的除氨和除H2S能力,确定筛选目标菌株。

1.4 菌株鉴定

1.4.1 显微形态和培养形态特征分析。

将筛选所得的目标菌株于LB培养基上划线培养,于培养箱30 ℃培养18 h,观察菌株形态特征,并对菌落形态拍照;挑取单菌落进行革蘭氏染色,并于光学显微镜下观察其显微形态。

1.4.2 生理生化特征分析。

菌株大部分生理生化特征利用Biolog Gen Ⅲ型细菌鉴定仪的微孔板检测,具体按照Biolog Gen Ⅲ MicroPlateTM使用说明书步骤操作,其微孔板布局如图1所示。其他生理生化试验检测内容参照赵斌等[10]的《微生物学实验》进行操作。将LB培养基NaCl含量调节为1%、4%、8%和10%(w/v),pH分别调节为5、6、7、8、9、10、11,检测菌株生长pH范围和NaCl耐受情况,检测菌株在7、15、25、30、40、45和50 ℃条件下的生长情况。

1.4.3 菌株16S rRNA基因序列的测定及系统发育树构建。

参照细菌基因组DNA提取试剂盒(杭州博日科技有限公司)的说明书提取细菌基因组DNA。用细菌通用引物(正向引物27F 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′,反向引物1492R 5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)参照张飞官等[11]的方法扩增菌株16S rDNA。PCR产物在生工生物工程(上海)有限公司进行测序。将测得的16S rRNA基因序列提交到GenBank,获得各菌株的登录号。参照张越己等[12]的方法构建系统发育树。

2 结果与分析

2.1 菌株的分离

从5个鸡粪发酵物样品中分离获得52株菌株,其中细菌38株,放线菌14株。在利用试纸检测各菌株产生NH3和H2S气体的过程中发现,有5株细菌同时不产生NH3和H2S,它们分别是3-1、3-2、4-3、5-2、5-4,分别检测了这5株菌的除氨和除H2S能力,结果如表1所示,从表1可看出,菌株3-1的除氨率和除硫化氢率均为5个菌株中最高的,分别达到了63.08%和62.98%,因此选该菌为最优的目的菌株确定其分类地位。

2.2 菌株的鉴定

2.2.1 形态特征。

菌株3-1是革兰氏阳性的好氧细菌,在LB培养基上的菌落呈现出隆起、边缘整齐的形状,菌株表面湿润,无可溶性色素,菌株为乳白色,培养过程中菌株颜色无变化,无金属光泽,在光学显微镜下观察发现该菌呈现杆状,如图2所示。

2.2.2 生理生化特征。

菌株3-1培养22 h后在Biolog鉴定板上的鉴定结果如图3所示。将该菌Gen Ⅲ鉴定板上的鉴定结果在数据库中比对,未发现有与该菌结果具有匹配可能性的菌株,距离最近的菌为Bacillus megaterium,但与该菌的相似度(SIM)为0.212,距离(DIST)为10.253,无匹配可能性。鉴定结果表明该菌具有一定的耐酸性和耐盐性,可在pH 低至5和含8%NaCl的培养液中生长,生长温度是15~30 ℃。可利用糊精、D-麦芽糖、D-纤维二塘、蔗糖、D-松二糖、水苏糖、棉子糖、蜜二塘、D-水杨酸、N-乙酰神经氨酸、D-葡萄糖、D-果糖、D-甘露醇、D-阿拉伯醇、甘油、L-丙氨酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-焦谷氨酸、L-丝氨酸、果胶等生长。

2.2.3 菌株16S rRNA基因部分序列分析。

菌株3-1的16S rRNA基因部分序列长度为1 424 bp,在GenBank核酸登录号为OM816730。根据菌株3-1系统发育分析,菌株3-1属于贝氏谷氨酸杆菌属(Glutamicibacter)细菌,与该属菌株原磷谷氨酸杆菌Glutamicibacter protophormiae DSM 20168系统发育关系最近,其16S rRNA基因相似性为99.93%;其次是菌株Glutamicibacter soli SYB2,相似性为99.07%;通过邻接法构建的基于菌株3-1相关菌株16S rRNA基因部分序列的系统发育树如图4所示。结合其形态特征、生理生化特征和16S rRNA基因部分序列分析结果[13],初步判定菌株3-1属于原磷谷氨酸杆菌(Glutamicibacter protophormiae)。

3 讨论

在已有的降解畜禽粪污臭气方面的研究中,发现具有这类功能的微生物主要包括芽孢杆菌[14]、镰刀菌[15]、酵母菌[16-17]等,该研究所得的降解氨气和硫化氢的菌株为原磷谷氨酸杆菌(Glutamicibacter protophormiae),已有的报道中该类菌主要具有产生L-谷氨酸、谷氨酸等功能[17],鲜有该类菌用于降价畜禽粪污臭气成分的报道。该研究筛选出的菌株3-1对氨气和硫化氢都有较好的去除效果,具有研发为功能菌株生产除臭剂的潜力,为除臭菌剂的研发等后续研究打下了基础。

参考文献

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基金項目 成都市重点研发支撑计划项目(2022YF0500956SN);四川省农业科学院国际科技交流合作提升行动计划项目(2021ZSSFGH05)。

作者简介 吴翔(1981—),女,四川理县人,副研究员,博士,从事土壤微生物研究。

收稿日期 2022-05-06

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