海水浸泡对火器伤致兔股骨开放性骨缺损愈合影响的实验研究

张 淦,刘胜杰,王 智,陈聪聪,马武秀,陈肖松

(中国人民解放军联勤保障部队第九〇一医院 骨科, 安徽 合肥 230031)

骨缺损是临床上常见的损伤,由爆炸物、车祸或者外伤引起损伤。由于创伤严重,因此感染的风险高,不及时或不恰当的治疗易引起骨不连、延迟愈合等。海水具有高渗、高碱、低温、含菌量高等特点。海水浸泡可通过损伤骨折断端骨痂成骨细胞中细胞膜、线粒体等,进而影响骨折愈合[1]。王长生等[2]通过海水浸泡骨折断端处骨膜,表明海水浸泡影响骨膜,膜内成骨明显延缓。海水浸泡火器伤较单纯火器伤组织损伤更加严重,浸泡时间越长,损伤程度越重。海水浸泡会加重局部血流循环,最终加重损伤周围组织缺血缺氧[3]。但海水浸泡对火器伤所致的骨缺损愈合的影响,国内外未见报道。因此本文探讨海水浸泡对火器伤所致肢体开放性骨缺损愈合的影响。

1 材料与方法

1.1 仪器和试剂 OLYMPUS-IX71倒置显微镜(日本Olympus公司);钢板及螺钉(常州康辉医疗器械有限公司);20%乌拉坦(上海士锋生物科技有限公司);荧光定量PCR仪(Bio-rad);中国东风速射运动手枪SS04型,口径为5.6 mm;子弹质量2.5 g;人工海水由天津中盐公司提供,海水主要理化指标:渗透压(1 250.00±11.52) mmol/L,pH值8.20,钠离子浓度(630.00±53.30)mmol/L,平均密度1.025 g/cm3。

1.2 实验动物 56只新西兰大耳兔,由安徽医科大学动物实验中心提供,体重2.5～3.0 kg,雌雄不拘,清洁级。

1.3 实验分组 随机分为2组,每组28只。对照组:单纯火器伤组;实验组:海水浸泡火器伤组。

1.4 手术方法 以20%乌拉坦(4 mg/)耳缘静脉麻醉。随机选择一侧兔后肢,大腿去毛。于兔后肢股骨中段进行枪击,枪口距离20 cm,造成股骨干开放性骨缺损。A组(对照组)行常规清创+股骨复位内固定,一期闭合伤口。B组(海水浸泡火器伤组)将兔浸泡于人工海水1 h,之后再行常规清创+股骨复位内固定,一期闭合伤口。术后实验动物分笼饲养,隔日换药,1周后予以伤口拆线。实验兔每天给予肌肉注射青霉素40万单位,连续注射3 d。

1.5 观察指标

1.5.1 放射学检查 于术后第1、3天、第1、2、4、8、12周各取6只行X线摄片,观察骨痂生长情况。

1.5.2 RT-PCR检测 摄片处死后取材进行实验室检测,收集各组兔股骨骨痂组织,按照TRlzol试剂说明书提取样本的总RNA,用紫外分光度计测量总RNA的浓度,按照反转录试剂盒说明书的方法将RNA反转录为cDNA,然后进行RT-PCR检测,观察骨缺损部位周围骨痂组织中缺氧诱导因子-1α mRNA(HIF-1α mRNA)、血管内皮生长因子mRNA(VEGF mRNA)表达情况。引物序列:HIF-1α(F)5’-TCTCATCCAAGAAGCCCTAACG-3’,(R)5’-GGCTGCTGTAATAATGTCCCAAT-3’;VEGF(F)5’-TCCACCCACGACAGAAGGGGA-3’,(R)5’-TCACCGCCTTGGCTTGTCACA-3。GAPDH(F)5’-TGAAGGTCGGAGTGAACGGAT-3’,(R)5’-CGTTCTCAGCCTTGACCGTG-3’。反应条件:95 ℃预变性10 min,95 ℃、10 s,55 ℃、20 s,40个循环。溶解曲线:95 ℃、1 min,55 ℃、1 min,95 ℃、10 s,以GAPDH作为内参,用2-ΔΔt方法计算出HIF-1α、VEGF的相对表达量。

1.5.3 骨组织HE染色 于术后第2、4、8、12周摄片后,各组随机处死6只,取股骨原来缺损区域骨组织,将标本用福尔马林固定1 d,EDTA脱钙1个月,石蜡包埋,行HE染色,观察病理改变。

2 结果

2.1 实验动物一般情况 实验兔有1只在麻醉后死亡,立即补齐。术后1 d,实验兔开始活动和进食,B组有1只兔伤口出现感染,青霉素80万单位肌注,3 d后死亡,补做1只实验兔。其余实验兔伤口未出现感染,一期愈合。

2.2 HIF-1α mRNA及VEGF mRNA表达 各组各个时间段HIF-1α mRNA均有表达,两组HIF-1α mRNA表达随着时间增加先呈递增趋势,之后出现递减,高峰出现在术后第2 周。术后1、3 d,1、2周,A组(对照组)HIF-1α mRNA表达低于B组(实验组),差异有统计学意义(P< 0.05);术后4、8、12周,两组HIF-1α mRNA表达,差异无统计学意义(P>0.05,表1)。各组各个时间段VEGF mRNA均有表达,两组VEGF mRNA表达随着时间增加先呈递增趋势,之后出现递减,高峰出现在术后第2 周,术后1、3 d及1、2、4周,A组(对照组)VEGF mRNA表达高于B组(实验组),差异有统计学意义(P<0.05);术后8、12周,两组VEGF mRNA表达,差异无统计学意义(P>0.05,表2)。

表1 不同时间点HIF-1α mRNA的相对表达量

表2 不同时间点VEGF mRNA的相对表达量

2.3 影像学观察 术后第2周A、B组未见明显骨组织影,术后第4周A、B组骨缺损区有薄云状骨痂阴影。术后第8周A、B组骨缺损区域骨组织阴影增强。术后第12周,A组断端达骨性愈合,髓腔部分再通,部分完成修复;B组皮质连续性好,但髓腔未完全再通(图1)。

A:对照组术后第2周X线片;B:对照组术后第4周X线片;C:对照组术后第8周X线片;D:对照组术后第12周X线片;E:实验组术后第2周X线片;F:实验组术后第4周X线片;G:实验组术后第8周X线片;H:实验组术后第12周X线片。图1 不同时间点两组兔股骨摄片

2.4 组织学观察 术后第2周A组骨缺损区域骨细胞变性,少量纤维组织、肉芽组织增生,少量炎细胞浸润,血管增生不明显。B组骨缺损区骨细胞变性,纤维组织增生,较多炎细胞浸润。术后第4周,A组纤维组织增生活跃,软骨组织增生,骨样基质形成,血管增生明显。B组以纤维组织增生为主,少量软骨组织增生,偶见骨样组织形成,少许血管增生。术后第8周,A组可见纤维组织减少,大量编织骨形成,可见不规则骨小梁。B组可见少量软骨组织形成,骨样基质形成,未见不规则骨小梁。术后第12周,A组大量成熟板层骨,骨小梁较规则排列,髓腔部分再通;B组少量成熟板层骨,骨小梁不规则骨小梁,骨小梁窄细、稀少,髓腔未通(图2)。各组术后第2、4、8、12周Lane-Sandhu组织学评分比较(表3)。

A:对照组术后第2周;B:对照组术后第4周;C:对照组术后第8周;D:对照组术后第12周;E:实验组术后第2周;F:实验组术后第4周;G:实验组术后第8周;H:实验组术后第12周。图2 不同时间点两组兔骨组织HE染色

表3 不同时间点Lane-Sandhu组织学评分

3 讨论

海水具有高渗、高碱、低温和含菌量高等特点。碱性海水可以引起细胞内外离子浓度失衡,加重细胞损伤反应,最终导致细胞坏死。碱性海水抑制凝血机制,加重了损伤组织小血管出血,浸泡后组织细胞内脱水,间隙水肿,外周灌注减少,浸泡出水后,外周灌注改善,发生缺血再灌注损伤。高渗海水进入损伤组织,使得细胞内外离子浓度差加大,从而增加细胞膜上离子泵的负担,消耗更多的能量,诱发氧化还原反应,抑制细胞活性,加重组织及细胞坏死程度[4-5]。陈肖松等[1]将实验兔伤肢放入海水浸泡3 h,伤后7 d通过电镜扫描观察海水浸泡骨损伤处,发现成骨细胞损伤严重,线粒体、细胞核溶解,细胞膜及核膜破坏。

火器伤的常规处理为早期彻底清创,二期闭合伤口。但在野外海战条件下清创后二期闭合伤口,伤病员往往住院时间长、康复时间长、并发症多等,不符合军人伤员快速归队的现实需求。同时,目前已有学者对一些局部软组织损伤及污染轻的火器伤,早期彻底清创后一期闭合伤口,取得了满意的疗效[6-9]。Wright等[10]认为,骨折内固定能有效防治火器伤致骨折感染,降低感染的发生率。及时彻底的清创是预防感染发生的关键,本实验中所有实验兔伤口均获得彻底清创,HE染色中均未见炎性细胞。

在X线片及HE染色上可看出两组实验兔缺损处新骨形成随着时间的延长逐渐增多,但相同时间点内,单纯火器伤组形成的新骨要比海水浸泡火器伤组多,术后12周单纯火器伤组骨缺损基本达到愈合,而海水浸泡火器伤组未达到骨性愈合。X线及HE染色表明,海水浸泡影响火器伤致兔股骨骨缺损愈合。林建宁等[11]研究表明,骨折经过海水浸泡后,骨折愈合率明显降低,最终导致骨折愈合延迟。

骨缺损的修复是一系列相关细胞活动有序进行的产物。首先,骨缺损处发生急性炎性反应,随后出现肉芽组织浸润,骨祖细胞聚集、增殖和分化,基质的形成和钙化,最后骨修复完成。生物学信号、力学信号在骨缺损修复过程中起重要作用。VEGF和HIF-1α是促进骨折修复重要的细胞因子。VEGF是血管生成的调节因子,介导新血管生成,具有促进血管形成的作用[12]。新生血管的形成对骨折愈合极其重要,新生血管为骨折愈合提供营养及原料。HIF-1α可以通过2种方式促进骨缺损愈合,一种是直接调节骨系细胞功能,另一种是促进VEGF的表达[13]。此外,在低氧条件下,HIF-1α可以通过促进核心结合因子α1表达,间接激活间充质干细胞向成骨细胞方向分化,同时促进成骨细胞发育,最终促进骨缺损愈合[14]。通过PCR可以看出,海水浸泡火器伤组及单纯火器伤组HIF-1α的表达均在造模后早期即开始逐渐升高,海水浸泡火器伤组升高较单纯火器伤组更明显。这与海水浸泡加重火器伤所致的局部低氧状态有关。本实验中在术后早期海水浸泡火器伤组VEGF表达低于单纯火器伤组,说明海水浸泡影响VEGF的表达。这与海水浸泡严重损伤成骨细胞、骨祖细胞等细胞有关。同时陈肖松等[1]证明海水浸泡影响骨祖细胞、纤维细胞、软骨细胞、成骨细胞等细胞VEGF的表达。

综上所述,海水浸泡可能通过诱发原始成骨细胞出现变性、坏死,抑制断端组织(包括骨祖细胞、纤维细胞、软骨细胞、成骨细胞)的VEGF表达的途径,导致火器伤所致骨缺损愈合延迟。