自发性早产肝功能检测指标全基因组关联分析

周 方 蒋永红 陈松长 陈红岩 卢大儒

世界卫生组织 (world health organization,WHO) 将女性从末次月经期第一天算起,妊娠少于259天或者妊娠少于37周的分娩定义为早产[1]。根据2019年的研究报道,全球平均早产率为10.6%,中国早产率为6.9%[2]。早产对新生儿的生活质量具有显著影响,使一些疾病的风险增加,给早产儿家庭造成巨大的心理和经济负担。孕妇妊娠开始后,需要通过自身代谢提供母婴的共同能量需求,代谢增强,使得肝脏负荷增加。肝功能受损会引起妊娠期影响孕妇妊娠结局[3]。

肝功能检测 (liver function test,LFTs) 是在临床上常见的检测肝病的手段,同时也可以作为其他器官疾病的辅助检测指标,例如糖尿病、代谢综合征等[4]。常见的 LFTs 指标包括丙氨酸氨基转移酶 (alanine aminotransferase,ALT)、胆红素 (total bilirubin,TB)、碱性磷酸酶 (alkaline phosphatase,ALP)、天冬氨酸氨基转移酶 (aspartate transaminase,AST)、γ-谷氨酰转肽酶 (γ-glutamyl transpeptidase,GGT) 等[5,6]。肝功能检测指标的遗传在欧洲、美洲、东亚等不同人群中存在群体差异性[7～11]。

参照中国三甲医院制定的产检时间表,孕妇需要在妊娠第12周和分娩前进行肝功能检测。通过近20年妊娠期肝功能异常相关文章的Meta分析表明,妊娠期肝功能异常与早产显著相关(OR=4.48,95% CI：3.89～6.60)[12]。妊娠期肝功能指标ALP、AST、GGT是早产的独立危险因素,但是早产孕妇的肝功能检测指标在全基因组层面的关联研究尚未开展[13,14]。

本研究旨在通过对上海国际和平妇幼保健院自然妊娠并成功分娩的自发性早产孕妇的DNA进行基因分型,结合其产前肝功能检测指标数据,在早产孕妇人群中确认与肝功能检测指标相关的基因,此外,为进一步探索早产的相关机制提供研究基础。

材料与方法

1.一般资料：本研究获得上海国际和平妇幼保健院医学伦理学委员会审批通过[伦理学审批号：国科伦委(GKLW)2019-50]。所有入组患者或家属均知情同意,研究者管理遵循国际和国内的相关法律法规。本研究一共纳入了2018年8月～2020年9月在上海国际和平妇幼保健院进行分娩的自发性早产孕妇样本344例,并获取产前BMI、产前肝功能检测数据、分娩年龄、孕妇疾病等临床信息。所有入组病例产检时保留的血样,经过离心后保留血细胞沉淀,于-80℃保存备用。使用德国QIAGEN公司生产的QIAamp DNA Mini试剂盒提取血细胞沉淀DNA,利用中国生捷科技(杭州)有限公司生产的YZ01基因芯片对进行SNP分型实验,共获取1017032 个单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)位点分型信息。

2.自发性早产孕妇的纳入标准：①单胎自然妊娠;②活胎分娩;③胎龄<37周;④临产启动分娩;⑤排除医源性早产(任何威胁母婴健康的因素导致的早产,包括妊娠糖尿病、胎窘、妊娠高血压、子痫、肝脏疾病等)。

3.数据分析：针对344个样本的分型数据后,使用PLINK软件(version 1.90 b6.21)对获取的分型数据进行初步质控。样本的分型结果需要满足以下标准：个体分型率>95%,近郊系数在均数±3标准差范围内,删除亲缘关系较近样本,通过主成分分析(principal component analysis,PCA)去除偏离整体目标群体的样本。SNP 分型结果过滤标准需满足：SNP位点分型率>95%,保留下348602 SNPs使用shapeit4、Minimac4分别进行单倍型分析、基因型填充 (参考单倍型为千人基因组 Phase 3 东亚人群)。再次使用PLINK软件对基因型填充后数据进行SNP位点的质控,质控标准为：SNP分型率>95%、最小等位基因频率 (minor allele frequency,MAF)>0.01,哈温平衡检验P>1.00×10-5。利用PLINK软件进行分别以TB、AST、ALP、GGT 为连续变量,以分娩年龄、生化检测孕周、PCA前5个主成分为协变量进行校正,做全基因组关联分析(genome-wide association analysis,GWAS)。在全基因分析中P=5.00×10-8设定为全基因组显著水平,P=1.00×10-5设定为具有潜在相关水平。使用 Rstudio软件中R包qqman 包绘制曼哈顿图和膨胀因子计算,利用在线网页 Locus Zoom绘制显著SNP 附近的局部关联图。在 ClinVar数据库中查询易感 SNP对应的临床信息。为估算 SNP 的调控能力,参考 RegulomeDB数据库对 SNP 进行功能基因组学打分。利用MAGMA软件 (version 1.09b) 将单个SNP位点与表型关联P值富集到基因水平,进行全基因组关联分析,对PLINK分析结果进行验证确认,以P<0.05为基因与表型存在显著关联。该软件可以克服单个SNP位点与表型关联微弱,不易通过PLINK 软件的分析识别出与表型的关联的不足,对PLINK的结果进行再次验证。

结 果

1.研究人群和芯片数据：通过对上海国际和平妇幼保健院产妇临床信息的筛查,以及SNP分型数据质控,最终共获取336例自发性早产孕妇在产前的肝功能检测指标数据和基因分型数据。质控后,共获得 4805010 个SNP 位点分型数据。

2.PLINK全基因关联分析筛选差异位点：以肝功能检测指标作为连续变量,使用 PLINK软件,以分娩年龄、取样孕周、PCA前5个主要成分为协变量,利用一般线性模型进行GWAS分析。观察到分别有88个、2个、102个、15个SNP与 TB、ALP、GGT、AST达到全基因组显著相关 (P<5.00×10-8)。曼哈顿图显示,经协变量矫正后的GWAS分析,发现在不同染色体上存在与TB、ALP、GGT、AST显著相关的SNP位点(图1)。在本研究中,关于肝功能检测指标GWAS分析的膨胀系数 (λTB=0.991,λALP=0.973,λGGT= 0.977,λAST=0.998) 均接近于1,证明研究人群不存在明显的群体分层。具有全基因组显著性的SNP附近位点的连锁不平衡情况(图2)。

图1 自发性早产人群肝功能检测指标的曼哈顿图A.TB-GWAS;B.ALP-GWAS;C.GGT-GWAS;D.AST-GWAS

图2 自发性早产孕妇肝功能检测指标关联区段局部图A.TB-rs13002774;B.TB-rs2648892;C.ALP-rs1928935;D.GGT-rs184339019;E.AST-rs76293449;F.AST-rs1949002;紫色菱形为最显著 SNP 位点,深蓝色圆点为显著SNP附近 SNP,下方为注释基因,箭头表示转录方向

3.显著相关SNP位点功能分析：利用VarNote 数据库对所有达到全基因组显著相关 (P<5.00×10-8) 的 SNP进行注释,并在ClinVar 中查询对应SNP的临床信息(表1)。共有3个与TB水平相关SNP 存在临床意义,分别与吉尔伯特综合征、血清胆红素、药物反应相关。使用 RegulomeDB对所有显著SNP的调控能力进行打分(表2),UGT1A基因簇与 TB,PTPRK、LAMA2与GGT、AST之间的关系。

表1 自发性早产孕妇肝功能指标相关位点临床意义

表2 PLINK 与MAGMA肝功能检测指标GWAS分析结果比较

4.MAGMA全基因组关联分析：使用MAGMA 软件,基于PLINK分析获得单个SNP 与肝功能检测指标的关联P,将P富集到基因水平,在基因水平上分析与肝功能检测指标相关的基因。与PLINK分析获得结果进行比较发现,UGT1A1基因簇与TB、MROH2A与TB、PKHD1与GGT、SMAD6与AST、LAMA2与AST、ZNF与AST的相关性得到了验证。其他不一致的位点主要是PLINK 分析中识别出的位于基因间的SNP位点(表2)。

5.与自发性早产和肝功能检测指标同时相关的基因：针对MAGMA分析获得的与肝功能检测指标相关的基因,与目前已发表的与早产相关的基因进行筛选比较。发现在自发性早产样本中,肝功能指标相关的基因(P<0.05),同时与早产具有显著相关性。在与早产相关的基因中,TNR、IL10、HTR3A、B3GNTL1、RAB31与TB依然相关,RALB、PMP22、STAT5B、B3GNTL1、TEKT3与ALP依然相关,LOC283710与GGT依然相关,MKNK1、MAML3、VAV2、HTR3A与AST依然相关。

讨 论

本研究使用PLINK 和MAGMA两款软件对基因型填充后的SNP分型数据做全基因组关联分析。结果发现,UGT1A1基因簇与血清胆红素TB依然显著相关,这与已有的韩国、西班牙、中国、美国研究结果一致[7,8,10,15,16]。UGT1A基因簇在胆红素代谢中起到重要作用,血液中胆红素水平升高,会导致吉尔伯特综合征[17]。但是,并未在本研究人群中发现,SLCO1B1基因座与血清中的高水平胆红素相关,尽管其在欧美和欧洲人群中存在相关性[9,10]。使用MAGMA软件的分析结果中,在早产孕妇样本中验证了基因DNAJB3与TB的相关,与韩国、中国人群的GWAS分析结果一致[7,8]。DNAJB3的表达降低与2型糖尿病有关,胆红素浓度升高与2型糖尿病也有密切联系[18,19]。另外,通过本研究,在中国人群中发现基因ATG16L1、MROH2A与TB的相关,这2个基因分别在韩国、西班牙、美国人群的研究中发现与TB浓度呈现相关[8,10,15]。

另外,本研究验证了基因ABO与ALP的相关性。基因ABO负责编码糖基转移酶,催化 ABO 血型抗原结构的形成,因此推测不同血型同工酶变化可能与ALP 水平有关[7]。

本研究在中国人群中发现了与GGT相关的基因PKD1、EDAR。EDAR基因编码肿瘤坏死因子受体家族的一个成员。EDA是一种肝因子,主要表达于肝脏,分泌进入循环系统,参与能量和糖脂代谢[21]。EDA通过剪接变体EDA- a1结合EDA受体(EDAR),导致细胞内EDAR相关死亡结构域 (EDARADD) 适配器蛋白的招募和NF-κB信号通路的激活,肝组织分泌的EDA与非酒精性脂肪肝有关[22]。通过MAGMA软件的分析,首次发现基因ATP8B1、MICAL3 与GGT的相关,该结果与之前在欧美人群中的报道的一致[20]。ATP8B1参与胆汁转运,编码在胆汁形成和流动中起关键作用的胆管转运蛋白,其突变与进行性家族性肝内胆汁淤积有关,并与高GGT浓度相关。

通过PLINK和MAGMA两款软件的数据分析,在世界范围内发现基因SMAD6、LAMA2、ZNF883基因与AST的相关,但相关机制尚未有相关报道,有待于进一步探索。通过MAGMA软件分析,笔者发现了大量未被报道的,与肝功能检测指标相关的基因,同时与早产相关,例如与TB相关的TNR、IL10、HTR3A、B3GNTL1、RAB31,与ALP相关的RALB、STAT5B、B3GNTL1、PMP22、TEKT3;与GGT相关的LOC283710,与AST相关的MKNK1、MAML3、VAV2、HTR3A[23]。

综上所述,本研究在中国344例早产孕妇样本人群中,同时使用PLINK和MAGMA两款全基因组关联分析软件,对于肝功能检测指标开展全基因组关联分析。一方面,验证了在中国人群中,与肝功能检测指标关联的基因,为进一步研究不同人群肝功能检测指标人群特异性提供了基础;另一方面,筛选出部分与早产和肝功能检测指标均相关的基因,为进一步研究早产机制提供关键信息。