复硝酚钾和亚磷酸钾对‘富士’苹果激素含量及相关成花基因表达的影响

宋耀峰,张林森,赵紫嫣,陈枫楠,刘 宇,赵先飞,于国康,王林林

(西北农林科技大学 园艺学院,陕西杨凌 712100)

在中国苹果栽培地区,‘富士’占总苹果栽培面积比例较大。但‘富士’幼树枝条易旺长,花芽难形成,大小年现象严重。果树枝条生长过旺时,会打破营养生长和生殖生长之间的平衡关系,不利于果树花芽分化。目前,生产上虽然通过许多农艺措施如扭枝、环割、拉枝等技术措施来控制果树的过旺生长[1],但其人工费用高,也有采用一些化学方法,如喷施多效唑等会造成大量农药残留,影响果实品质和环境安全。因此,在果树生产中使用一些高效安全、绿色环保的措施来调节果树花芽分化,对提高苹果产量及经济效益具有重要 意义。

花芽分化受到多种因素的影响,果树花芽分化的基础是营养,关键过程是花芽中内源激素的动态平衡,其需要的途径是花芽分化过程中的基因表达[2],在这些条件下果树花芽分化才可以顺利进行。植物的花芽分化主要分为花芽生理分化期和花芽形态分化期[3]。成花诱导阶段是花芽生理分化期的重要阶段[4],主要发生在花后的3～6周[5],苹果花芽形态分化期一般发生在花后12周。果树的花芽孕育与枝条停止生长有关[3],对花芽分化影响的诸多因素中苹果枝条的停长是花芽分化开始的先决条件之一。因此,控制枝条旺长形成花芽也是获得高产的关键技术之一。植物激素在植物生长发育过程中具有重要作用,参与了花芽分化的过程,影响植物的成花,激素平衡与否,将决定着芽是向花芽还是叶芽的方向转变。植物激素如细胞分裂素(CTK)、脱落酸(ABA)、生长素(IAA)和赤霉素(GA),通过多种开花途径调节开花[6-9],各激素之间通过相互影响和协调来调控植物的开花。苹果成花的分子机理一直是人们研究的重点,目前在调控苹果成花的分子机理上已形成多种调控途径,各途径之间相互影响并汇聚到整合因子上,诱导花分生组织的基因表达,使植物最终开花[10-12]。

复硝酚钾是1997年经美国国家环保局批准,进入美国绿色食品工程唯一人工合成植物生长调节剂,复硝酚钾及其制剂被国际粮农组织(FAO)指定为绿色食品工程推荐的植物生长调节剂,目前在文心兰上的研究认为,复硝酚钾对文心兰幼苗的生长有一定的正效应,浓度越高,抑制效应越明显[13]。目前在国外,亚磷酸钾在农业领域的应用主要是作为一种杀菌剂在防疫病害和植物营养的功能性肥料方面,亚磷酸盐被称为肥料和杀菌剂[14-16]。亚磷酸盐作为一种功能性的肥料在国外已广泛应用,而在我国研究的较少,亚磷酸态的3价磷具有双向运输的功能,可同时在作物木质部和韧皮部进行运输,能够加快植物对营养的吸收和利用,它可以促进草莓、马铃薯等植物的开花,提高产量[17]。本试验在‘富士’苹果生长季从生理和分子的角度揭示喷施复硝酚钾和亚磷酸钾影响‘富士’成花的机制,为生产上人工调控苹果成花,缓解‘富士’大小年问题提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验点位于陕西省宝鸡市千阳县南寨镇西北农林科技大学千阳苹果试验示范站,试验区经度107°59′48.5″,纬度34°7′22.5″。该地区属暖温带半大陆性气候,年均气温10.9 ℃,年降水量653 mm。以‘长富2号’/‘M26’/‘新疆野苹果’为试验材料,树龄为8 a,果园株行距为3.5 m×1 m。

1.2 试验设计

在2020年预备试验的基础上,2021年生长季共设4个处理,分别为清水对照CK、T1(复硝酚钾1 mg·L-1)、T2(亚磷酸钾3 340 mg·L-1)、T3(复硝酚钾1 mg·L-1+ 亚磷酸钾 3 340 mg·L-1)。试验采取随机区组设计,每个处理1株,有9个重复,每个处理之间有1棵防护树,在5月20日、6月20和7月20日分别进行喷施,所选试验树树干周长一致,果园其他管理措施基本一致。

1.3 测定项目与方法

1.3.1 枝条生长量测定 从处理的试验树上东西南北方向随机选择20个当年生新梢,用植物标签做好标记,测定时间从喷施的时间开始到生长季结束,测定的时间为每两周1次直至生长季节结束,最后计算当年生枝条长度的平均生长量。

1.3.2 短枝顶芽内源激素含量测定 分别于3次喷施处理后第10天时采集4个处理短枝上的花芽,共采3次,芽采集完成后要迅速用锡箔纸包好,立即放入液氮后带回实验室存放-80 ℃冰箱保存,用于测定花芽内源激素含量。内源激素在提取和测定之前,将样品从-80 ℃冰箱取出放入液氮中研磨好后称取0.3 g,每个处理有3个生物学重复,将研磨好的不同处理的样品放入经过灭菌的10 mL的离心管中(离心管在放样之前要在液氮中进行预冷),然后立即放入提前在试剂公司预定好的20 kg的干冰中,隔热密封好后,快递邮寄至中国农业大学植物激素研究所,并由该研究所通过间接酶联免疫吸附测定法进行IAA(生长素)、ABA(脱落酸)、GA3(赤霉素)、ZR(玉米素核苷)等内源激素含量的测定。

1.3.3 短枝顶芽相关成花基因表达量测定 在初次喷施之日后,采集喷施复硝酚钾、亚磷酸钾、复硝酚钾+亚磷酸钾以及对照4个处理的短枝顶芽,每隔15 d采集1次,共采集4次,采集完成后要立即将所有样品用锡箔纸包好并做标记好后放置液氮中保存,带回实验室放置于-80 ℃低温冰箱内保存,用于测定芽内相关成花基因的表达量。

短枝顶芽RNA的提取采用天根RNA试剂盒进行提取,提取完成后用2%琼脂糖凝胶电泳对其完整性进行验证,cDNA的合成使用的是塔克拉反转录试剂盒(TaKaRa Bio,Japan),使用NCBI设计成花相关基因的引物序列(表1),qRT-PCR步骤按照塔克拉荧光定量预混试剂盒说明书进行,MdActin作为内参基因,计算基因的表达量采用2-ΔΔCt法进行。

表1 成花相关基因定量PCR引物序列Table 1 Primers designed for flower related genes

1.3.4 次年成花率调查 调查次年苹果树露红期花簇数量,计算花密度。

花密度=花簇数量/树干横截面积

树干横截面积测定是树干从地面往上10 cm左右的垂直距离时测量的周长,然后计算半径并求出横截面积。

1.4 数据处理

数据的处理和文图的制作采用Excel 2019,数据的显著性方差分析采用SPSS 11.5 (SPSS,Chicago,IL,USA)(P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 喷施复硝酚钾与亚磷酸钾对‘富士’苹果新梢生长的影响

由表2所示,在盛花期后1个月的时间里新梢迅速增长,各处理间无显著差异。在5月中旬喷施处理后,与对照相比,喷施T1(复硝酚钾)、T2(亚磷酸钾)和T3(复硝酚钾+亚磷酸钾)处理下春梢长度分别为34.6 cm、31.6 cm、30.8 cm,而对照为43.4 cm,T2和T3比对照显著地减少27.19%、29.03%。在7月中旬时,与对照相比,T2和T3显著地降低了枝条的生长量,分别减少29.25%和28.26%。在苹果整个生长季节结束时,枝条经喷施处理后,都有一定的控制效果,其中T1、T2和T3处理下秋梢上长约2 cm,而对照喷清水上长10 cm左右。综上所述,说明在喷施复硝酚钾、亚磷酸钾处理3次时,可以显著地抑制枝条后期的生长。

表2 喷施复硝酚钾和亚磷酸钾对不同时间‘富士’苹果枝条平均长度的影响Table 2 Effects of compound potassium nitrophenolate and potassium phosphite application on mean shoot length in‘Fuji’apple tree cm

2.2 喷施亚磷酸钾和复硝酚钾对‘富士’苹果花芽内激素含量的影响

由图1可知,‘富士’树经喷施处理后,随着喷施次数的增加,IAA的含量呈下降趋势,喷施第2次和第3次时,T3(复硝酚钾+亚磷酸钾)处理下IAA的含量与对照相比差异显著(图1-A)。ZR的含量随着喷施次数的增加呈现先增高后降低的趋势,喷施第2次和第3次时,各处理间与对照相比, T3(复硝酚钾+亚磷酸钾)处理下ZR的含量显著提高且高于其他处理,且差异显著(图1-B)。GA3的含量和IAA的含量整体趋势一致,在整个测定时期内,GA3的含量随着喷施次数的增加呈现逐渐下降的趋势,喷施第1次时其他各处理和对照相比较差异显著。喷施第3次时GA3的含量明显降低,且差异显著(图1-C),与对照组相比,各处理对ABA的含量影响较小,ABA喷施第1次时含量较高,其他处理时期含量都比较低,且只在第3次喷施时有比较明显的差异(图1-D)。

同一喷施次数之间不同小写字母表示显著性差异水平(P<0.05)。下同

2.3 喷施复硝酚钾和亚磷酸钾对相关成花基因表达的影响

图2结果显示,MdSOC1在花后45 d时一直处于低表达,但在花后60 d后表达量上调,其中在花后60～75 d时表达量增加,与对照相比,T3处理都高于对照且差异显著。MdFT和MdSOC1的趋势基本一致,在花后45 d时低表达差异不明显,在花后45 d以后,芽内MdFT的表达水平显著上升,在花后60 d时,MdFT各处理的表达量都高于对照,且差异显著。在花后45 d和60 d对MdLFY的表达水平显著提高,在花后 60 d时,T3处理的表达显著高于其他处理,且差异显著。在花后45 d后,MdFD的表达量逐渐增加,在60 d、75 d、105 d,MdFD的表达水平上调,在花后60～75 d时,各处理间的表达水平都高于对照且差异比较显著。MdTFL-1的表达水平在花后45 d开始被显著下调,在花后45 d时,与对照相比,各处理之间的表达量都低于对照,且T3处理下差异比较显著。MdGA20ox的表达量出现先降低后升高的趋势,在花后45 d ～60 d,MdGA20ox的表达显著被下调,在花后45 d时,各处理都低于对照且差异显著,在花后60 d时,与对照相比,亚磷酸钾处理下的MdGA20ox差异显著,在花后105 d时,MdGA20ox的表达量虽然升高,但与对照相比降低且差异显著。

图2 不同处理下短枝顶芽内相关成花基因的表达Fig.2 Expression of related flowering genes in short shoot buds under different treatments

2.4 喷施复硝酚钾和亚磷酸钾对‘富士’苹果成花的影响

如表3所示,对次年成花率而言,与对照相比,各处理开花数量上高于对照,T1(复硝酚钾)和T2(亚磷酸钾)处理后差异不显著,T3(复硝酚钾+亚磷酸钾)处理下开花数量显著提高了 63.14%,在花序密度上各处理高于对照,但差异不显著。

表3 喷施复硝酚钾和亚磷酸钾对‘富士’苹果次年成花的影响Table 3 Effects of compound potassium nitrophenolate and potassium phosphite on flowering of‘Fuji’apple in next year

3 讨 论

在影响花芽分化的诸多因素中,苹果枝条的停长是花芽分化开始的先决条件之一。在对文心兰幼苗的生长研究中发现,高浓度的复硝酚钾能显著抑制幼苗的生长[13]。亚磷酸钾作为一种高磷高钾的肥料,可以调节叶片气孔关闭,促进新梢老熟[18]。在番茄上,高浓度的亚磷酸钾会抑制植株的生长[19],在对沃柑的研究中也发现,春梢期喷施亚磷酸钾可以对新梢转绿老熟速度有明显的促进作用[20]。本研究结果表明,‘富士’苹果在喷施复硝酚钾和亚磷酸钾后,与对照相比,T2和T3显著降低了29.03%～31.64% 和27.18%～ 30.33%,这与前人在文心兰、番茄和沃柑上研究的高浓度喷施处理情况下能抑制生长的结论相一致。从本试验结果可以看出,‘富士’枝条被显著地抑制是在枝条生长季节多次喷施3次后,可使春梢提前停长,防止秋梢旺盛生长,平衡营养生长与生殖生长的关系,从而在花芽分化的进程中使芽的顶端向有利于花芽形态的方向转变,促进苹果成花。

不同的植物激素会对成花产生不同的生理反应,在花芽的调控中发挥着促进或者抑制作用,植物体内激素的平衡对是否形成花芽起着关键作用,激素作为一种重要的因子,不仅在果树花芽分化中起到重要作用[21],也对成花途径中基因的表达具有重要的影响。前人研究表明,在内源激素中,IAA浓度较高不利于花芽分化[22],梁武元等[23]在对荔枝的研究中也表明,生长素含量低会促进果树的花芽分化。本试验中,在喷施复硝酚钾和亚磷酸钾后,花芽内IAA的含量是下降的,且随着喷施次数的增加,T3处理下IAA的含量显著低于对照,这与前人研究结果一致,说明IAA含量低是有利于成花的。而ZR的含量变化情况正好与IAA相反,随着喷施次数的增加,T3处理下ZR的含量都显著高于对照,这与曹尚银等[24]所说的ZR能促进果树花芽分化和植物内源激素ZR含量随成花进行不断增加[25]的研究结果一致,说明高含量的ZR对促进花芽分化具有积极意义。有研究认为,IAA和CTK之间具有显著的动态平衡关系,IAA含量的降低,可能会使ZR含量增加[26],而ZR作为CTK重要的运输形式,与CTK的作用原理相一致。因此,本试验中内源激素IAA含量减少,ZR含量增加,在T3处理下差异显著的原因可能是在多次喷施后且复硝酚钾和亚磷酸钾复配后共同作用下,改变了芽内的激素含量的动态变化情况,促进了花芽的形成。在中秋脆枣中,内源激素GA3的含量与对照相比,明显都高于对照[27]。前人多项研究表明,GA3在果树花芽分化时期具有抑制的作用,低含量的GA3有利于果树的花芽分化。本研究中,GA3的含量和IAA的含量整体趋势一致,随着喷施次数的增加,GA3的含量呈现下降的趋势,且在喷施第3次时与对照相比各处理间GA3含量显著下降,推测可能的原因是复硝酚钾和亚磷酸钾多次喷施且在共同作用下,使芽内有利于成花的激素累积增加,不利成花的GA3的含量下降,促进了成花。有研究表明,高含量的 ABA 对树体营养生长起抑制作用,但能促进花芽孕育、提高果树成花率[28]。本试验中喷施处理后ABA的含量在起初较高,但后期各处理组ABA的含量逐渐下降但各处理之间差异不显著。关于ABA与成花相关的理论说法不一,在花芽孕育临界期,ABA的含量会上升[29],也有人认为,ABA 主要与枝条停长有关,可能使枝条提前停长的作用而影响花芽的形成[30]。本试验研究表明,ABA含量只在喷施的初期有显著的提高,但后期含量确有下降,可能本试验中ABA是通过枝条的停长来间接地影响花芽分化的。

花后的30～80 d是花芽孕育的关键时期,本试验选取成花调控途径中的几个关键的成花基因从分子的机理方面来研究喷施复硝酚钾和亚磷酸钾对‘富士’苹果成花的影响。有研究报表明,FT在果树成花的过程中发挥着重要作用[31],FT基因编码的蛋白质能够调节成花相关芽的分生组织,促使其向生殖生长的方向转变,促进成花[32-33],并且FT与FD编码的蛋白相结合后,能够调节茎尖与花芽相关的组织而促进基因表达,使植物开花[34]。本研究结果显示,‘富士’经喷施处理后,MdFT表达水平被上调,在花后60 d时,T3处理下FT的表达量都显著高于对照,这与王超等研究的在花芽发育的整个阶段结果一致,同时,FD基因在花后60 d时也显著高于对照,这与‘富士’苹果在喷施NAA后FD基因在盛花后60 d时处理组显著高于对照[35]的结果一致。说明复硝酚钾和亚磷酸钾对MdFT和MdFD的合成产生了重要影响。SOC1在植物开花途径中参与了多个途径的信号因子的响应,它整合了多个开花途径中的因子,启动调节LFY的表达。本试验中SOC1在花后45 d以后表达量上升,T3处理下的表达量最高且差异显著,同样在‘富士’经葡萄糖处理后也发现了同样的结果[36],说明经喷施处理后,促使SOC1整合了其他成花因子,促进了开花。LFY在花芽发育的进程中有重要的功能,它在果树营养生长向生殖生长转换过程中发挥着重要的作用。在本研究中,在花后60 d时,各处理间与对照相比存在显著差异,这与杜利莎等[37]研究结果一致。说明在45～60 d时促进了花芽的形成。此外,成花抑制基因MdGA20ox作为赤霉素成花途径中的重要基因,可能与花芽内GA的含量有关,GA20ox作为一种关键的氧化酶,它在GA合成过程中发挥着关键作用[38]。本试验中,GA20ox在花后45 d时显著下调,与芽内MdGA20ox在成花起始期则开始下调表达[39]的观点一致。TFL1在苹果和梨的花芽诱导早期表达量较高,但在转化至起始阶段表达量下降[40-41]。同样在‘金坠’梨中的表达量也在下降,说明其抑制成花[42]。本试验中在花后45 d开始后MdTFL-1表达水平被下调,但只在花后45 d时,T3处理的表达量显著低于对照,这与前人研究中TFL-1基因的下调表达相一致。

本试验只是在喷施处理后研究了其内源激素具体的动态变化过程,从生理机制的角度说明了复硝酚钾和亚磷酸钾可以通过调控‘富士’花芽内激素的动态变化来促进‘富士’的花芽分化。

同时,在分子水平上选取了与成花相关的几个关键基因来揭示喷施复硝酚钾和亚磷酸钾影响‘富士’苹果成花的机制,验证了喷施处理后在成花的关键时期相关成花基因得到了表达,最终促进了形态上花芽的形成,为研究苹果成花的途径提供了新的思路与方法,也为生产上人工调控苹果的成花方法提供新的理论依据,但是在花芽内部激素和基因表达上是如何变化和调控即其作用机理还需进一步研究。