甘草水氮效应研究及基于有效成分的水氮方案

吕学莲,李 明,白海波,惠 建,李树华,郭生虎,李云翔,马海军,许 兴

(1.宁夏大学 农学院,银川 750021;2.宁夏农林科学院 农业生物技术研究中心,银川 750002;3.宁夏农林科学院 林业与草地生态研究所,银川 750002,银川 750002;4.宁夏农林科学院植物保护研究所,银川 750002;5.北方民族大学 生物科学与工程学院,银川 750021)

甘草(GlycyrrhhizauralensisFisch.),多年生豆科草本植物,是中医药宝库中的珍品,也是鲜为人知的大宗中药材。甘草“浑身是宝”,其根茎部位具有清热解毒、抗癌消炎、调和诸药等医学功效,地上部分是优质的饲草及功能饲料来源[1]。

20世纪末,由于野生甘草不合理采挖,导致野生资源储量急剧减少。人工种植甘草的兴起,解决了一时的燃眉之急,但也伴随着新的问题,即药用成分含量较低。通过对全国甘草产区采集的大量甘草样品检测发现,野生甘草的甘草酸含量平均为4.43%,远高于栽培甘草的1.51%[2]。随着甘草应用越来越广,市场需求不断扩大,在当前野生资源不足的情况下,人工栽培甘草也是一种很有效的解决手段,关键是通过何种途径能将人工栽培甘草的品质提高。甘草中主要的活性成分是三萜类及黄酮类,而甘草酸及甘草苷分别是这两大类物质中的代表性物质,也是《中国药典》中评价甘草质量优劣的依据[3]。据报道,甘草药用成分含量的高低与遗传因素[4-5]、产地[6]及生长阶段[7]和栽培条件[8]有关。因此,在现有栽培条件下,如何平衡好各影响因素,使其对甘草品质起到正向的调控作用,是值得研究的关键问题。

人工甘草栽培过程中,最直接的农艺措施是灌水和施肥。研究发现氮、磷、钾对甘草酸含量影响为施氮>施磷>施钾[9];适度的水肥耦合对甘草产量具有明显的促进作用[10];氮、磷、钾肥料不同配比对甘草中甘草酸和甘草苷含量影响不同[11];施磷量对甘草产量的影响呈现先增加后增产不显著的趋势[12];单施氮肥有利于甘草地上部分生长,单施磷肥主要促进根系生长,混施氮磷不仅能促进甘草生长,还能提高甘草酸含量[13]。灌水与氮肥对甘草生长指标和药用成分含量之间关系的研究鲜见报道,且目前甘草栽培缺乏有效的水肥指导依据。本试验以乌拉尔甘草为研究对象,在宁夏中部干旱带沙生土壤进行水肥试验,设立不同梯度的灌水和氮肥组合,研究水氮效应对甘草生长及有效成分含量的影响,并优化出宁夏中部干旱带沙生土壤甘草灌水施氮方案,为甘草种植的高质量发展提供科学的栽培依据。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

试验于2019年4月-2020年11月在宁夏中部干旱带盐池县沙边子甘草种植基地 (106°30′～107°41′E,37°04′～38°10′N)进行,该区域属中温带大陆性气候,干旱少雨,风沙大,2019和2020年平均降水量分别为323 mm和201 mm,分布不均,2019年主要集中在6、7和8月,2020年主要集中在 8 月,年均蒸发量为2 180 mm,远大于降水量。年均气温大于20 ℃的月份为6-8月(图1)。此区域能代表宁夏甘草道地产区的典型气候特征。试验地上年闲置,未施肥。土壤类型为砂质土,全盐为0.1 g/kg,pH 8.52。1 m深土壤平均有机质为2.16～4.39 g/kg,全氮为0.20～0.55 g/kg,有效磷为1.30～9.34 mg/kg,速效钾为56.8～85.7 mg/kg,碱解氮为4.79～10.19 mg/kg。

图1 2019(左)和2020年(右)盐池县月平均气温、日照时数及降水量Fig.1 Monthly average temperature,sunshine duration and rainfall in Yanchi county in 2019(left) and 2020(right)

1.2 试验设计

试验设4个水分处理(W)和4个氮肥水平(N),裂区设计,主区设置水分处理,分次灌水,灌水定额为750 m3/hm2,用水表控制灌水定额。不同水分处理生育期内分别灌1水(W1,灌溉定额750 m3/hm2)、2水(W2,灌溉定额1 500 m3/hm2)、3水(W3,灌溉定额2 250 m3/hm2)和4水(W4,灌溉定额3 000 m3/hm2),各水分处理之间设置5 m 隔离区,于4月底灌第1水,之后大概每间隔1个月灌1次水。在各水分处理内,设置4个氮肥水平,3次重复,随机区组排列。共48个小区,小区面积15 m2(5 m×3 m)。供试肥料为:尿素,含N 46%;磷酸二铵,含N 16%,含P2O544%;硫酸钾,含K2O 50%。全生育期施基础钾肥100 kg/hm2,磷酸二铵100 kg/hm2,氮肥随第2水一次性施入。因基肥磷酸二铵中含N 16%,实际氮肥用量为每个水平增加 N 16 kg/hm2,即N1:16 kg/hm2,N2:86 kg/hm2,N3:156 kg/hm2,N4:226 kg/hm2。于2019年4月中下旬移栽1 a生乌拉尔甘草实生苗,只进行水、肥处理,正常田间管理和农事操作,不测定性状。2020年继续同样试验处理,测定性状。

1.3 测定项目及方法

1.3.1 生长指标测定 于9月中旬进行甘草生长指标测定。每个小区随机挖取5株,调查株高、侧枝数、根长、根鲜质量、根干质量。株高(plant hight,PH):从植株基部至顶端的高度;侧枝数(branch number,B):主茎萌发出的侧枝数量;根长(root length,RL):从芦头至根尖顶端的长度;根鲜质量(root fresh mass,RFM):根部鲜物质质量;根干质量(root dry mass,RDM):根部烘干后的干物质质量。

1.3.2 有效成分含量测定 样品制备:于甘草采收季10月中旬采收试验处理的甘草植株根部,冲洗干净,烘干,用GT 300 型球磨仪对样品进行研磨,过60目筛。称取样品粉末0.1 g于10 mL容量瓶中,纯甲醇溶解定容后,称量,超声(250 W,40 kHz)提取30 min,放冷,再称量,用甲醇补足减失的质量,摇匀,用微孔滤膜(0.22 μm膜)过滤,取滤液,即得。于 4 ℃中保存,备用。

甘草酸(glycyrrhizic acid,GA)和甘草苷(liquiritin,L)含量测定:采用安捷伦1260液相色谱仪进行测定。色谱柱规格为C18,250 mm× 4.6 mm,流动相组成为0.1%甲酸水(A)和纯甲醇(B)。甘草苷检测波长276 nm,甘草酸检测波长254 nm,柱温40 ℃,流速为1.0 mL/min,进样量10 μL。梯度洗脱程序如表1。图2为甘草苷、甘草酸(A)标准品及样品(B)的色谱图。

表1 甘草酸、甘草苷色谱条件Table 1 Chromatographic condition of glycyrrhizic acid and glycyrrhizin

图2 甘草酸、甘草苷及甘草样品色谱图Fig.2 Chromatogram chart of glycyrrhizic acid,liquiritin and licorice sample

总黄酮(total flavonoids,TF)提取与检测:准确称取0.250 g制备好的甘草样品粉末于25 mL容量瓶中,用含0.2%氨水的80%乙醇溶液溶解定容,超声提取( 250 W,40 kHz)90 min,用滤纸过滤,即得总黄酮提取液,重复3次。吸取提取液5 mL于25 mL容量瓶中,加入300 μL 5% NaNO2溶液,摇匀后静置6 min,加入300 μL 10% Al(NO3)3溶液,摇匀并静置 6 min,再加入2 mL 4% NaOH溶液反应20 min,用 50% 乙醇定容,在510 nm测定吸光度,计算含量(%)。

1.4 数据处理与分析

采用SPSS 23.0统计软件进行方差分析,用Origin 2021软件绘图,利用DPS 7.05软件进行回归模型的建立及Topsis综合评价。

2 结果与分析

2.1 不同水氮组合对甘草生长的影响

由表2可知,灌水对株高具有极显著影响 (P<0.01)(表2)。灌水处理下,平均株高为 55.54～65.21 cm,相对于W1,W2、W3和W4灌水条件下的株高分别增加17.4%、17.1%和 16.1%。施氮对株高具有极显著影响。施氮处理下,株高随着氮肥水平先增加后降低,表现为 N3>N4>N2>N1,N2、N3和N4相对于N1,增幅分别为7.3%、10.5%和9.0%。水氮交互作用对株高影响显著(P<0.05)。水氮交互下,W2N4、W3N3、W2N3和W4N3的株高最高。

表2 不同水氮组合甘草生长性状Table 2 Licorice growth traits under different water and nitrogen combination

灌水对侧枝数影响极显著。灌水处理下,侧枝数随着灌水定额的增加而增加,表现为W4>W3>W2>W1,相对于W1,W2、W3和W4灌水条件下的侧枝数增幅依次为3.5%、10.2%和 20.0%。说明灌水可以增加侧枝数。施氮对侧枝数影响显著。施氮处理下,侧枝数随着氮肥施用量增加而增加,至N4稍有所降低,相对于N1,N2、N3和N4增幅依次为6.4%、10.7%和 9.1%。水氮交互作用对侧枝数影响不显著。水氮交互下,W4N3、W4N2和W4N4的侧枝数最多,分别为10.17、9.83和9.73。

灌水对根长具有极显著影响。灌水处理下,平均根长为26.81～37.65 cm,均随着灌水定额增加而增加,表现为W4>W3>W2>W1,相对于W1,W2、W3和W4灌水条件下的根长增幅依次为8.6%、12.7%和40.0%。施氮对根长影响显著。施氮处理下,根长随着氮肥水平先增加后降低,表现为N3>N4>N2>N1,相对于N1,N2、N3和N4增幅依次为3.6%、7.3%和3.5%。水氮交互作用对根长影响显著。水氮交互下,W4中各氮肥处理根长均较长。

灌水对根鲜质量具有极显著影响。灌水处理下,平均根鲜质量为17.24～21.01 g,相对于W1,W2、W3和W4灌溉定额分别使根鲜质量增加21.9%、19.7%和16.7%。施氮对根鲜质量具有极显著影响。施氮处理下,根鲜质量随着氮肥施用量先增加后降低,相对于N1,N2、N3和N4增幅分别为9.2%、15.9%和11.6%。水氮交互作用对根鲜质量影响显著。水氮交互下,W3N3和W2N4根鲜质量最大。

灌水对根干质量影响极显著(表2)。灌水处理下,平均根干质量为8.97～10.16 g,相对于W1,W2、W3和W4灌溉定额分别使根干质量增加了13.3%、12.8%和8.4%。说明灌水可以增加甘草根干质量。施氮对根干质量具有非常显著影响。施氮处理下,根干质量随着氮肥水平先增加后降低,相对于N1,N2、N3和N4增幅依次为11.7%、17.9%和10.2%。水氮交互作用对根干质量影响显著。水氮交互下,W2N3、W2N4和W3N3的根干质量最大。

2.2 不同水氮组合对甘草根部有效成分含量的影响

对不同水氮组合下甘草根部有效成分甘草酸含量的研究表明,灌水对甘草酸含量具有极显著影响(表3)。灌水处理下,甘草酸平均含量为 0.811%～1.206%,均随着灌溉定额增加而升高,相对于W1,W2、W3和W4灌水条件下的增幅依次为15.2%、34.1%和48.8%。施氮对甘草酸含量具有极显著影响。施氮处理下,平均甘草酸含量为0.962%～1.063%,相对于N1,N2、N3和N4增幅分别为9.1%、10.5%和0.2%。水氮交互作用对甘草酸含量影响显著(P<0.05)。水氮交互下,W4N2和W4N3甘草酸含量最高。

表3 不同水氮组合下甘草根部有效成分含量Table 3 Active ingredients contents in root under different water and nitrogen combination %

灌水对甘草苷含量具有极显著影响(表3)。灌水处理下,平均甘草苷含量为0.353%～ 0.655%,甘草苷含量均随着灌水定额增加而升高,相对于W1,W2、W3和W4灌水条件下的增幅依次为35.8%、56.9%和85.5%。施氮对甘草苷含量影响不显著。水氮交互作用对甘草苷含量影响极显著。水氮交互下,W4N3、W4N4和W4N2甘草苷含量最高,分别为0.701%、0.670%和0.651%。

灌水对总黄酮含量具有极显著影响(表3)。灌水处理下,总黄酮含量为5.566%～7.101%,相对于W1,增幅依次为-5.2%、15.4%和 21.0%。施氮对总黄酮含量具有极显著影响。施氮处理下,平均总黄酮含量为6.101%～ 6.756%,为N3>N4>N2>N1,相对于N1,N2、N3和N4增幅依次为1.4%、10.7%和2.8%。水氮交互作用对总黄酮含量影响显著。水氮交互下,W3N3、W4N1和W4N2总黄酮含量最高,分别为7.913%、7.331%和7.195%。

2.3 基于甘草酸、甘草苷及总黄酮含量的水氮因子优化

药用成分含量的高低是评价甘草质量优劣的最重要指标。为进一步探明水氮组合与甘草酸、甘草苷及总黄酮含量之间的关系,以灌溉定额和氮肥施用量为自变量,甘草酸、甘草苷和总黄酮含量为因变量,进行回归模拟分析,分别得到甘草酸、甘草苷和总黄酮与灌水定额(X1)和氮肥施用量(X2)、Y1、Y2和Y3的二次回归方程式。对回归方程的显著性检验表明:甘草酸Y1和甘草苷Y2的P<0.01,达到极显著水平,总黄酮Y3的P<0.05,达到显著水平,说明方程的拟合度较好,能够反映真实情况(表4)。

表4 灌溉定额、氮肥用量与甘草酸、甘草苷和总黄酮含量的回归方程Table 4 Regression equation of irrigation quota,fertilization amount and glycyrrhizic acid,liquiritin and total flavonoids

由灌溉定额、氮肥施量与甘草酸含量的回归模型可知,甘草酸含量随着灌溉定额和氮肥施量的增加呈先增加后减小的趋势,最高点坐标为 (3 000,108.86),此时对应甘草酸含量最高,为1.270%(图3)。在灌溉定额、氮肥施量与甘草苷含量的回归模型中,当灌溉定额为3 000 m3/hm2、纯氮施量为134.20 kg/hm2时,对应的甘草苷含量最高,为0.670%,当纯氮施量再继续增加时,甘草苷含量又有所降低(图4);在灌溉定额、氮肥施量与总黄酮含量的回归模型中,当灌溉定额为3 000 m3/hm2、纯氮施量为144.28 kg/hm2时,对应的总黄酮含量最高,为7.173% (图5)。

图3 水氮组合与甘草酸的回归模型Fig.3 Regression model of water nitrogen combination and glycyrrhizic acid

图4 水氮组合与甘草苷的回归模型Fig.4 Regression model of water nitrogen combination and liquiritin

图中*表示P<0.05;**表示P<0.01;***表示P<0.001。圆点颜色表示相关性值,大小表示相关性大小;图中 PH、B、RL、RFM、RDM、GA、L和TF分别代表株高、侧枝数、根长、根鲜质量、根干质量、甘草酸、甘草苷和总黄酮* indicates P<0.05;** indicates P<0.01;*** indicates P<0.001;color scheme indicates pearson correlation values.The size indicates the correlation.PH,B,RL,RFM,RDM,GA,L and TF indicate plant height,branch number,root length,root fresh mass,root dry mass,glycyrrhizic acid,liquiritin and total flavonoids图6 甘草生长指标与活性成分的相关性Fig.6 Correlation coefficients between growth traits and active ingredients of licorice

2.4 基于Topsis 综合评价的甘草高效水氮组合方案

利用Topsis 综合评价法对基于甘草酸、甘草苷和总黄酮含量的各处理进行综合评价,3个因变量指标权重都设为1,评价结果如表5所示。

表5 Topsis 综合评判结果Table 5 Topsis comprehensive evaluation

根据Topsis 综合评判结果C进行排序,W4N2排名第1,W4N3排名第2,即灌溉定额为3 000 m3/hm2,氮肥施量分别为86 kg/hm2和156 kg/hm2。而回归分析优化得到的灌溉定额与Topsis综合评价法的结果一致,氮肥施量范围也正好在Topsis法评判的最优的两个处理结果范围内。进一步证实宁夏人工栽培甘草有效成分积累的最适宜的灌溉定额为3 000 m3/hm2,氮肥施量为108.86～144.28 kg/hm2。

2.5 甘草生长指标与有效成分的相关性

由图 6 可知,株高(PH)、侧枝数(B)及根长(RL)均与甘草酸(GA)、苷草苷(L)及总黄酮(TF)之间呈极显著正相关关系(P<0.01);根鲜质量(RFM)与甘草酸(GA)、甘草苷(L)及总黄酮(TF)呈极显著正相关关系(P<0.01);根干质量(RDM)与甘草酸(GA)呈极显著正相关关系 (P<0.01),与甘草苷(L)及总黄酮(TF)呈显著正相关关系(P<0.05)。株高、侧枝数及根长与甘草有效成分含量相关性比较高,可作为甘草有效成分筛选的重要指标。

3 讨 论

3.1 水氮组合对甘草生长的影响

氮素是植物生长发育过程中必需的大量元素之一,也是促进植物生长和提高作物产量的重要原因[15]。本研究中氮肥用量从16 kg/hm2(N1)增加到86 kg/hm2(N2)时,能够使甘草株高、侧枝数、根长、根鲜质量和根干质量分别增加 7.31%、6.40%、3.63%、9.24%和8.69%,说明氮素在促进植株生长方面发挥了重要作用。但是氮素供给与植物生长需求并非呈直线关系,氮素过多会造成氮肥利用率下降,产投比降低[16]。如N3(156kg/hm2)相对于N1,能够使甘草株高、侧枝数、根长、根鲜质量和根干质量分别增加 10.52%、10.68%、7.25%、15.91%和15.41%,但N4(226 kg/hm2)相对于N1,能够使甘草株高、侧枝数、根长、根鲜质量和根干质量分别增加 9.01%、9.13%、3.49%、11.59%和9.24%,反而有所下降,原因可能是在N4处理下,由于氮浓度过高,试验区土壤中的氮处于“极丰”状态,超过了甘草生长所需要的范围,冗余的氮则留在了土壤中。这与前人对三七[17]、何首乌[18]的研究结论一致。

水也是植物生长发育及新陈代谢不可或缺的部分,植物必须有足够的水分才能完成各种生理生化过程,最终形成产量[19]。本研究灌溉定额从750 m3/hm2(W1)增加到1 500 m3/hm2(W2)时,能够使甘草株高、侧枝数、根长、根鲜质量和根干质量分别增加17.41%、3.49%、8.58%、 21.85%和10.66%,说明灌水能够使植株生长茂盛,根系发达。但水分也并非越多越好,本研究W3(灌溉定额2 250 m3/hm2)相对于W1处理,株高、根鲜质量和根干质量分别增加17.08%、19.71%和10.12%,W4(灌溉定额3 000 m3/hm2)处理相对于W1,株高、根鲜质量和根干质量分别增加16.14%、16.75%和6.40%,稍有所下降。但侧枝数和根长,均是随着灌溉定额的增加有所增加,说明水分对甘草各生长指标的影响也有一定的适宜范围。

氮素和水对作物的生长发育及产量的形成是相辅相成,又相互影响的[20]。适量的氮肥可以促进植物根系生长,有利于根系吸收土壤深层的水分,从而提高植物的水分利用效率。但施氮过量时,会导致氮利用效率降低,对水分利用效率没有促进作用。水分则影响植物对氮的吸收、同化、利用及转运分配[21]。本研究结果表明,W2N4和W3N3的株高、根鲜质量及根干质量的值最大,W4N3和W4N2侧枝数最多,W4水分处理下的根长均较长,说明适宜的水氮配比能够促进植株生长,利于根部干物质积累,水分对根系的伸长至关重要。这也证实了一定水分范围内,根系生长与土壤水分状况之间呈正相关关系,当土壤水分较少时,植物根系会寻找更多的水源,增加地上部向地下部运输的同化物质量,从而根系生长快于地上部分[22]。

3.2 水氮组合对甘草有效成分含量的影响

中药材的活性成分主要是药用植物积累的次生代谢产物,其含量高低与栽培环境密切相关,通过调整栽培措施,可以有效改善药材质量,提高产量及药效成分[23-25]。研究表明,不同地区生长的甘草的甘草酸及甘草苷含量有很大差异[26],这与当地的栽培条件密切相关。施用300 kg/hm2磷酸二铵与不施用相比,可以使甘草经济产量增加37.99%,生物产量增加43.02%,有效成分含量增加80.80%,经济效益增加62.45%[27]。目前生产上商品甘草多以乌拉尔甘草为主,因其产量高,品质好,深受市场喜爱。本研究中,氮肥用量从N1增加到N2,乌拉尔甘草中甘草酸、甘草苷及总黄酮含量分别增加9.05%、6.09%和 1.35%,说明使用氮肥可以提高甘草有效成分含量。当氮肥用量从N3增加到N4,甘草酸、甘草苷及总黄酮含量均下降。说明氮肥用量应控制在合理范围内,施用过多不但会影响有效成分的积累,还会造成经济效益及生态效益的降低。

前人研究表明,适度的干旱胁迫有利于甘草活性成分的积累[28]。本研究中,随着灌溉定额的增加,甘草酸、甘草苷及总黄酮含量均呈现增加的趋势,W4相比于W1,3种成分含量分别增加 48.75%、85.47%和20.99%,说明灌水对于甘草有效成分含量的积累具有直接的促进作用。该结果与前人结论中适度干旱促进活性成分积累的观点有所差别,主要原因是本试验立足于宁夏中部干旱带盐池县沙生土壤,此区域为全国西镇甘草的主产区,所产甘草色红皮细,品质优良,深受市场欢迎。但该区域气候比较干旱,地下水位较低,降雨量少,缺水是制约当地农业的瓶颈问题。甘草根系发达,生命力顽强,耐逆性强,适宜在这样的生境生存。本研究结果表明在W4灌溉定额下,甘草的水分利用效率较高,有效成分含量积累较快。

3.3 基于甘草有效成分含量的灌水和施氮方案

中药材的药用成分是植物与生长环境相互作用过程中,积累的能够提高自身保护和生存竞争力的次生代谢产物[29]。相对于农作物而言,中药材更注重于质量的提升,而衡量中药材质量好坏的依据,即药用成分含量。合理的水肥方案,能够促进有效成分积累,提高药材质量[30]。本研究利用二次回归模型研究因变量灌水、施氮与甘草中甘草酸、甘草苷及总黄酮含量之间的关系,拟合出灌溉定额为3 000 m3/hm2,氮肥施量为108.86～144.28 kg/hm2时,3种成分含量均达到最高,分别为1.270%,0.670%,和7.173%。此结果与前人[11,24]研究结论中氮肥效应的结果一致,即中等氮肥条件下有利于甘草活性成分的积累。高灌溉定额3 000 m3/hm2最有利于活性成分积累的结论,与试验区干旱的土壤水分状况,及砂性土壤不保水的特点相吻合。由于该地区属干旱地带,供水能力有限,3 000 m3/hm2已是最大用水限额,因此,灌溉定额最大只设定到3 000 m3/hm2。说明该地区对水分的需求量比较大,研究结果与当地的实际情况一致。该研究中甘草酸含量最高仅为1.27%,并未达到《中华人民共和国药典》规定的2.0%的标准,因在宁夏栽培模式下,人工甘草需移栽培3 a以上,而本研究是对移栽2 a的甘草所做的成分检测。