枸杞根腐致病菌及拮抗菌的分离鉴定

朱 杰,程 亮,3,姚 强,3,李秋荣,陈红雨,3,郭青云,3

(1.青海大学 农林科学院,西宁 810016;2.青海省农业有害生物综合治理重点实验室,西宁 810016;3.西宁农业农村部作物有害生物科学观测实验站,西宁 810016)

枸杞是茄科植物(Lyciumbarbarum),它不仅是中国传统的珍贵中药材,还被中国批准为药食同源的首批产品之一[1]。病害的发生会导致枸杞的产量及品质遭受严重的破坏[2],枸杞根腐病是青海省栽培枸杞林的主要病害之一,发病率高达53.2%以上,近几年还呈现逐步上升的趋势[3]。枸杞根腐病是一种全株性的系统病害,整个生育期都可发病,在青海省德令哈市、都兰县、诺木洪县、格尔木县和宁夏、内蒙古、新疆均有分布[3]。据报道,枸杞根腐病的致病菌约有9种:尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)、腐皮镰刀菌(F.solani)、同色镰刀菌(F.concolor)等[3-4],其中以尖孢镰刀菌致病力最强。尖孢镰刀菌属于镰刀菌属土传真菌,该菌引起的病害很难防治[5],其原因有:寄主植物根际分泌物会刺激尖孢镰刀菌孢子萌发和芽管生长[6];该菌会分泌细胞壁降解酶(CWDEs)和毒素进行侵染[7],其镰刀菌酸(FA)和伏马菌素(FB)等毒素会干扰宿主呼吸,损害宿主的抗病反应[8];镰刀菌具有逃避植物防御的调控基因[9],还有很强的环境适应能力[10]。

目前,防治枸杞根腐病害以培育种植抗病品种和使用化学药剂为主[11]。中国农业种植中过度使用农药,不仅污染环境,还威胁人类健康发展[12],而生物防治可以有效解决病原菌抗性、再猖獗以及农药残留等问题,同时还能促进绿色农业发展[13]。从植物根际土壤中分离出的生防菌在植物体表及土壤具有一定的定殖能力[14]。相比真菌和放线菌,生防细菌种类和数量繁多,繁殖速度较快,还能产生特有的细菌素[15]。生防细菌可以通过竞争作用,产生抑菌物质,诱导植物产生系统抗病性等方式有效抑制病原菌的危害[14]。Katz等[16]发现芽孢杆菌可以产生脂肽类、蛋白酶等以降解病原菌细胞壁。Balthazar等[17]发现芽孢杆菌可以诱导寄主植物激活自身的防御基因以此来响应病原菌的侵入。本试验分离鉴定枸杞根腐病病原菌后,以此为靶标,筛选具有拮抗效果的生防细菌,明确其种类,为枸杞根腐病的生物防治提供菌种资源和理论依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

病样采集:于2019-2021年 6-8 月从青海省海西蒙古族藏族自治州乌兰县(97°01′99.27″E,36°19′37.20″N,海拔 3 285 m);都兰县诺木洪(98°09′98°13″ E,36°30′36.39″N,海拔3 180 m);德令哈市柯鲁柯镇(90°07′99.46″E,35°01′39.19″N,海拔2 942 m) 采集具有典型枸杞根腐病病害症状的植株根茎部各10份,对其利用组织分离法分离纯化病原菌株,并对植株病害症状描述记录。

土壤样本:从青海省海西蒙古族藏族自治州乌兰县(97°01′99.27″E,36°19′37.20″N,海拔 3 285 m)栽培枸杞林中发病与未发病植株根际采集土壤样本各5份,利用稀释平板法对土样中细菌进行分离纯化,编号保存。

1.2 病原菌形态特征观察

将分离纯化后的菌株转移至PDA平板, 25 ℃恒温培养,直接观察并记录病原菌的菌落颜色、形态,生长速率;在显微镜下测量和记录菌丝、分生孢子的形态、分隔、大小。

1.3 病原菌分子生物学鉴定

选择形态鉴定后具有代表性的菌株,利用真菌试剂盒提取病原菌的DNA,选用引物ITS1/ITS4扩增基因间隔序列(ITS);引物EF-1H/EF-2T扩增翻译延伸因子基因序列(TEF-1α)(表1)。PCR反应体系(20 μL):正,反向引物 (10 μmol/L)各0.5 μL,DNA 模板 1 μL,2×PCR Mix 10 μL,dd H2O 8 μL。反应程序如下。

表1 所用引物序列Table 1 Primer sequences in this study

ITS:99 ℃预变性5 min,95 ℃变性45 s, 58 ℃退火45 s,72 ℃延伸1 min,30 个循环,最后72 ℃延伸5 min。

TEF-1α:94 ℃预变性5 min,94 ℃变性30 s,52 ℃退火45 s,68 ℃延伸50 s,35 个循环,最后68 ℃延伸5 min。

扩增产物提交杨凌天润奥科生物科技有限公司测序。测序结果与NCBI 数据库及GenBank 中已知序列进行相似性比对分析,再使用 MEGA 6.0 软件将目的序列与模式菌株进行多重比对,选用K2模型和邻近法(Neighbor-Joining)构建系统发育树,确定分离菌株的种属分类地位。

1.4 柯赫氏法则验证

按柯赫法则(Koch postulates) 进行验证,使用两年生枸杞苗,栽植于无菌营养土,放置于温室,提供适合菌株生长的温度和水分。将根茎处韧皮部用无菌刀片划开2～3 cm,取与伤口同面积的菌丝于划伤处,并用湿润的灭菌棉花包裹,使伤口处保持水膜状态。每个重复处理 3株,待发病后,观察发病症状,并取发病组织再次进行分离纯化,最后与接种菌株进行比较。

1.5 生防细菌的筛选

利用平板对峙法,将分离得到的细菌与病原菌分别置于NA、PDA培养基上,25 ℃恒温培养。于PDA平板中央接种直径为0.5 cm的病原菌菌饼,距离饼2.5 cm处用接种针点接细菌,以只接病原菌的PDA平板为对照,设置3次重复,培养7 d后观察细菌株对病原菌菌丝生长的抑制效果。其中以尖孢镰刀菌为靶标菌进行初步筛选,再利用尖孢镰刀菌、木贼镰刀菌、三线镰刀菌、黄色镰刀菌做为靶标菌进行复筛得到抑制率。

病原菌生长抑制率=(对照菌落直径-处理菌落直径)/对照菌落直径×100%

1.6 生防细菌的形态学鉴定

在NA培养基上,28 ℃恒温培养目的菌株 48 h,观察其菌落形态特征,并进行革兰氏染色。

1.7 生防细菌的分子生物学鉴定

利用细菌试剂盒提取生防菌的DNA,用引物进行PCR扩增,选用引物为:27F/1492R、UP1-F/UP-2R。分别扩增16S rDNA和GyrB基因序列,引物序列见表1。PCR反应体系同“1.3”,反应程序如下。

16S rDNA:95 ℃预变性5 min; 94 ℃变性30 s,58 ℃退火30 s,72 ℃延伸60 s,30个循环;72 ℃延伸10 min。

GyrB:95 ℃预变性5 min;95 ℃变性45 s, 60 ℃退火45 s,72 ℃延伸80 s,35个循环;72 ℃延伸10 min。

PCR 扩增产物和基因序列处理同“1.3”。

1.8 数据处理

所得数据用 DPS V9.01、SPSS 18.0软件进行方差分析和显著性分析。根据处理的数据用Microsoft Excel 2010制作图表。

2 结果与分析

2.1 枸杞根腐病病样的采集及分离结果

从青海省海西蒙古族藏族自治州乌兰县、德令哈市柯鲁柯镇、都兰县诺木洪栽培枸杞林采集的病样中共分离获得23株真菌。采集的病样症状为:植株地上部分无明显病变,感病较重的植株叶片变黄脱落;于植株根茎处,拨开韧皮部,可见褐色病变及白色霉层,严重时伴有腐烂(图1)。

图1 采集的枸杞根腐病样症状Fig.1 L.barbarum root rot-like symptoms

2.2 病原菌形态特征观察

根据在PDA平板上的形态对分离得到的23株真菌进行分类,共分为4种,分别为A类(G6-1,G6,GA-9-2)、B类(G6-2,GB-2-2,GB-2-3)、C类(G2-2,GA-2)、D类(LG-1,LG-1-1,LG-1-2,LG-1-3,LG-2,LG-3,LG-4,LG-5,LG-6,LG-6-1,G9-2,GA-3,GA-3-4,GB-6,GB-6-2),另选取D类中5株具有代表性的菌株(LG-4,LG-3,LG-1-3,LG-1-2,LG-6-1)进行分子生物学鉴定,以上4类真菌的形态学特征如下。

2.2.1 A类 菌丝稀疏,菌落正反面初期为中间深红,四周浅红,气生菌丝毡絮状,后期菌落中心开始出现黄色,7 d可长满整个皿。其分生孢子中间弯曲不明显,两端分隔细胞稍尖,3～5个隔膜,大小为6.90～14.73 μm,菌丝直径平均约为1.40～2.65 μm,产孢细胞直接生长在菌丝上,为单瓶梗(图2)。初步鉴定为黄色镰刀菌(F.culmorum)。

A1/A2.菌落正/反形态;A3/A4.分生孢子及孢子梗形态;A5.厚垣孢子形态;A6.菌丝形态

2.2.2 B类 菌丝致密,菌落正面中心白绿,外围紫红色/黄色。中间与外围菌丝有明显分界线,背面菌落中心呈米黄色,外围淡褐色,7天可长62.32 mm。小型分生孢子呈柠檬形/梨形/瓜子形,大型分生孢子1～3个隔膜,平均4.07～7.01 μm,菌丝直径约为2.5～7.5 μm(图3)。初步鉴定为三线镰刀菌(F.tricinctum)。

A1/A2.菌落正/反形态;A3/A4/A5.分生孢子及孢子梗形态;A6.小型分生孢子形态

2.2.3 C类 菌丝稀疏,部分菌落有轮纹,呈毡絮状,7 d可长78.48 mm,菌落正面白色/淡粉色,背面白色/淡粉色,菌丝直径平均约为1.6～3.5 μm。小型分生孢子卵型,大型分生孢子分隔 1～3个,平均大小为16.56～20.91 μm,产孢类型为单生(图4)。初步鉴定为木贼镰刀菌(F.equiseti)。

A1/A2.菌落正/反形态;A3.菌丝形态;A4/A5.分生孢子及孢子梗形态;A6.小型分生孢子形态

2.2.4 D类 菌丝致密,隆起;毡絮状,后期簇状,微湿;菌落圆形,表面干燥,不透明,正面白色或菌落正面中心嫩黄色,背面肤色,边缘白色或嫩黄色。菌丝长势较慢,7 d可长38.11 mm,菌丝直径平均约为1.56～3.16 μm。其小型分生孢子数量多,椭圆形,0～1 分隔,多数无隔,平均大小约为7.34～10.89 μm,单生(单瓶梗产孢,产孢梗短)及假头状聚生(图5)。初步鉴定为尖孢镰刀菌(F.oxysporum)。

2.3 病原菌分子生物学鉴定

经同源性比较分析后发现,基于rDNA-ITS基因序列所测长度为510～560 bp,TEF-1α基因所测序列长度为660～690 bp。将病原菌的5.8S rDNA和28S rDNA基因间隔序列(ITS)和翻译延伸因子基因序列(TEF-1α)联合构建系统发育树,结果表明:菌株GB-2-3、G6-2、GB-2-2与三线镰刀菌(F.tricinctum)模式菌株Z5(EF611092.1)和WAC:12337(JF776666.1)以100%序列相似性聚为一枝,菌株LG-4、LG-3、LG-1-3、LG-1-2、LG-6-1以100%序列相似性与尖孢镰刀菌(F.oxysporum)模式菌株ATCC 34298(DQ452454.1/ DQ452431.1)和ATCC 16416(DQ452450.1/ DQ452427.1)聚为一枝,菌株GA-2、G2-2与木贼镰刀菌(F.equiseti)模式菌株NRRL 26419(NR_121457.1/GQ505599.1)以100%相似性聚在一枝,菌株GA-9-2、G6-1、G6与黄色镰刀菌(F.culmorum)模式菌株EI3b(KC311482.1)和WN75(GU370481.1) 以100%序列相似性聚为同一枝(图6)。

T.模式种,下同

综上,可将菌株GB-2-3、G6-2、GB-2-2鉴定为三线镰刀菌(F.tricinctum),菌株LG-4、LG-3、LG-1-3、LG-1-2、LG-6-1鉴定为尖孢镰刀菌(F.oxysporum),菌株GA-2、G2-2鉴定为木贼镰刀菌(F.equiseti),菌株GA-9-2、G6-1、G6鉴定为黄色镰刀菌(F.culmorum)。

2.4 柯赫氏法则验证

从枸杞根腐病病株上共分离出 23 个菌株,经形态学和分子生物学鉴定后对其进行柯赫氏法则验证。选取健康的2 a生枸杞苗进行试验发现,接种清水对照(图7-E)未发病,接种尖孢镰刀菌、三线镰刀菌、木贼镰刀菌、黄色镰刀菌的植株发病,且发病情况与取样时的病症相似。

A.接种黄色镰刀菌;B.接种三线镰刀菌;C.接种木贼镰刀菌;D.接种尖孢镰刀菌;E.接种清水

接种黄色镰刀菌的植株叶尖变黄;接种部位有些许白色霉层,向上延伸,病部未见明显的变色(图7-A)。接种三线镰刀菌的植株叶片颜色和形态均无明显变化;接种部位变成黑褐,向上延伸,维管束中央呈红色病变,与正常维管束颜色差距较大(图7-B)。接种木贼镰刀菌的植株叶片无黄化现象。接种部位发生黄褐色病变,维管束组织呈现浅褐色(图7-C)。接种尖孢镰刀菌的植株维管束无明显变化,叶上部无明显变化,接种部位发成黄褐色病变,有明显白色霉层(图7-D)。

对病部进行再分离,鉴定,能获得与原接种菌株形态及种类一致的病原菌。根据柯赫氏法则验证,试验中的尖孢镰刀菌、木贼镰刀菌、三线镰刀菌、黄色镰刀菌均为枸杞根腐病的病原菌。

2.5 生防细菌的筛选

2.5.1 初筛结果 从土壤中分离到660 株细菌菌株,以尖孢镰刀菌为靶标利用平板对峙法初步筛选每株细菌的拮抗效果(图8),发现:对尖孢镰刀菌有拮抗作用的有8株,分别是QH-664、QH-667、QH-668、QH-588、QH-001、QH-468、QH-400和QH-390。

图8 拮抗细菌初筛Fig.8 Preliminary screening of antagonistic bacteria

2.5.2 复筛结果 利用4种枸杞根腐病原菌为靶标进行复筛,结果发现:QH-668、QH-667、QH-664、QH-588、QH-468、QH-400、QH-001和QH-390这8株生防菌对黄色镰刀菌、三线镰刀菌、木贼镰刀菌、尖孢镰刀菌均具有抑制效果;其中菌株QH-588对这4株病原菌的抑制效果最好,抑制率依次为:45.95%、36.09%、41.52%、51.79%;其次是菌株QH-468和QH-001。另外,菌株QH-668、QH-667、QH-664对病原菌的抑制率相差不大,抑制率较小的为菌株QH-400和QH-390(表2)。

表2 生防菌复筛抑制率Table 2 Re-screening inhibition rate of biocontrol bacteria

2.6 生防细菌的形态学鉴定结果

菌株QH-588、QH-668、QH-667、QH-664、QH-468、QH-001、QH-400和QH-390的革兰氏染色均为紫色,表明这8株生防细菌均为革兰氏阳性菌(图9-i-9-p)。除菌株QH-400、QH-390菌落在NA培养基上透明,呈白色,泛青,表明干燥外(图9-b,9-c),其余菌株的菌落在NA培养基上均为乳白色,不透明,边缘不规则,表明不光滑(图9-a,9-d-9-h)。经形态学初步鉴定菌株QH-400、QH-390为芽孢杆菌属(Bacillus)。

a、b、c、d、e、f、g、h依次分别为QH-001、QH-390、QH-400、QH-468、QH-588、QH-664、QH-667、QH-668的菌落形态;i、j、k、l、m、n、o、p.依次分别为QH-001、QH-390、QH-400、QH-468、QH-588、QH-664、QH-667、QH-668的革兰氏染色

2.7 生防细菌的分子生物学鉴定

将生防细菌的16S基因序列和GyrB基因序列联合构建系统发育树,结果表明:菌株QH-468、QH-668、QH-664、QH-001、QH-667与枯草芽孢杆菌(B.subtilis)模式菌株BCRC10255(NR_116017.1/DQ309293.1)以100%序列相似性聚为一枝,菌株QH-588以100%序列相似性与萎缩芽孢杆菌(B.atrophaeus)模式菌株BCRC 17123(EF433409.1/DQ309296.1)聚为一枝,菌株QH-390、QH-400与短小芽孢杆菌(B.pumilus)模式菌株ATCC 7061(NR_043242.1/JN575338.1)以100%相似性聚在一枝(图10)。综上,可将菌株QH-001、QH-468、QH-664、QH-667、QH-668鉴定为枯草芽孢杆菌(B.subtilis);菌株QH-390、QH-400鉴定为短小芽孢杆菌 (B.pumilus);菌株QH-588鉴定为萎缩芽孢杆菌(B.atrophaeus)。

图10 基于 16S和GyrB基因序列联合构建生防菌菌株的系统发育树Fig.10 Phylogenetic tree of biocontrol bacterial strains based on 16S and GyrB gene sequence

3 讨 论

枸杞根腐病是青海省栽培枸杞林的主要病害之一,通过分离鉴定发现海西蒙古族藏族自治州枸杞根腐病原菌有:三线镰刀菌、黄色镰刀菌、尖孢镰刀菌、木贼镰刀菌4种,分离比分别为: 13.04%、13.04%、65.22%、8.70%,其中以尖孢镰刀菌为主。这与宁夏和甘肃靖远县分离出的枸杞根腐病主要致病菌一致[2,19]。据报道,枸杞根腐病的致病菌约有9种:尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)、腐皮镰刀菌(F.solani)、同色镰刀菌(F.concolor)、串珠镰刀菌(F.monilifome)、锐顶镰刀菌(F.acuminatum) 、黄色镰孢(F.culmorum)、木贼镰刀菌 (F.equiseti)、寄生疫霉(Phytophthoranicotianae)和立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)[3-4],本研究鉴定出的三线镰刀菌为首次报道。镰刀菌分布极其广泛,能危害多种作物。除枸杞根腐病以外,镰刀菌属中的三线镰刀菌、黄色镰刀菌、尖孢镰刀菌、木贼镰刀菌同时能引起马铃薯干腐病[22]、苜蓿根腐病[23]等。镰刀菌不仅能分泌毒素进行侵染,在伴随谷物生长时,还会产生玉米赤霉烯酮、单端孢霉烯族化合物、丁烯酸内酯[24]等毒素,这些毒素对人类的健康具有很大的威胁。人们发现在生防菌的抑制作用过程中,病原菌会通过各种途径缓解生防菌的抑制[25]。生物防治目前是防治镰刀菌病害的有效手段,如卫传昊等[26]发现生防菌GHt-q6发酵液对尖孢镰刀菌的抑制率可达78.38%,张小彦[3]发现中华根瘤菌和绿僵菌对枸杞根腐病原中的腐皮镰刀菌抑制率分别为52.29%和 39.80%。传统的生物防治大多采用单一菌株防治单一病害,但生防菌使用中会出现适应性差、防治效果不好等问题,生防菌组合可以延长生防菌的作用期限,提高生防效果和稳定性[27-28]。如葛红莲等[29]利用生防细菌组合防治辣椒青枯病,相比单一菌株, 复合菌剂更能适应多种病原物、环境变化和多种类型的土壤。本研究亦对后期使用组合生防菌防治枸杞根腐病害有借鉴作用。