基于PCR技术的羊肉成分溯源鉴定检测方法研究

随着经济的发展以及生活水平的提高，人们对食品安全的关注度日益提高，肉类食品掺假问题越来越受到重视。目前，对肉类食品掺假的鉴定方法多样，主要包括形态分析、代谢产物分析、蛋白质分析、核酸分析等。其中，以DNA检验技术为基础的PCR检测是一种较为全面的检测方式，也是目前最具权威性的一种检验方法，在羊肉成分溯源鉴定中被广泛使用。本文重點阐述了以DNA检验为基础的PCR技术在羊肉成分溯源鉴定中的应用。

一、羊肉质量现状

当下，羊肉掺假现象屡禁不止，市场上有很多以鸭肉、猪肉等肉类为原料制作的羊肉卷，这种肉类的原料来源不明或已变质，很可能会对消费者造成伤害；还有些伪劣羊肉中过量添加色素、香精及其他违禁物质，长时间食用会增加人体肝脏的负荷，对人体健康造成威胁。

羊肉造假掺假现象之所以屡禁不止，根源就在于高利润。首先，羊的生长时间较长，且生育率较低，生产成本较高，因此与猪肉、鸡肉、鸭肉等相比，羊肉的市场价就更高。其次，羊肉具有较高的营养价值，比猪肉的肉质要细嫩，比猪肉、牛肉的脂肪、胆固醇含量都要少，容易被人体消化吸收，能提高身体免疫力。基于上述两大原因，羊肉的价格一直居高不下，这就导致一些不法分子和不法商家会掺入劣质肉来获取高额利润。

二、基于PCR技术的羊肉成分检测方法研究

1.常规PCR。常规PCR技术最早应用于食品中的微生物分析领域。谭慧敏团队利用此法测定了5种不同种类共计56个肉类原料，掺假发生率为75%。张谊团队主要以线粒体cytB为目标，对其进行了引物的设计，利用多种PCR的检测方式识别了牛肉中存在的其他肉类（牛肉、水牛肉）成分；项爱丽团队以线粒体16 SrRNA为基础，构建一对普通的引物，利用双重 PCR的方式识别出在混合肉中存在的多种类肉成分；李志敏团队瞄准了羊的线粒体D环一个特殊的目标区域，对其设计引物，并使用高种属PCR的方式识别掺假羊肉，这种方式的灵敏度为0.1%，羊肉DNA的检测限可以达到1pg。

总之，常规PCR具有很高的灵敏度和特异性，但由于不是在封闭管道中进行，因此样品有被污染的可能。

2.实时荧光定量PCR。实时荧光定量PCR技术实质上就是对DNA进行定量分析，有两种方法，一种是Taq法，另一种是SYBR Green法。

吴海晶等采用探针Taq法检测鸭源掺假，在鸭肉和羊肉混合料中检测到1%的鸭源成分，检出限达到10fg。对比Taq法，SYBR Green法通过将荧光基团添加到反应系统中，在PCR指数放大过程中对荧光信号进行连续监控，对特异性产物的数量进行实时监控，对目标基因的标准曲线进行定量分析。史莹莹等采用MY作为通用引物，采用SYBR荧光定量PCR技术，对市场上常见肉类（猪肉、牛肉、山羊肉、绵羊肉、鸭肉、鸡肉）进行了DNA提取和检测，成功检测到了各种肉品的DNA，对于含有1%猪肉的模拟肉品，其检测限为0.1ng，对于含有0.1%羊肉的模拟肉品，也能检测到羊肉成分，其检测限为0.01ng。陈传君团队利用RT-PCR技术，以线粒体蛋白B作为目标基因，对猪肉、牛肉、羊肉中的掺假物进行了快速、准确的分析，并在火腿肠中检出了猪肉、牛肉、羊肉。

综上所述，荧光定量PCR技术自动化程度高、特异性强、灵敏度高，还可以实现实时性及高定性、定量判断。但是，这种方法的使用条件非常苛刻，而且成本也比常规PCR要高得多。

3.环介导等温扩增技术。环介导等温扩增（LAMP）技术是近年来发展起来的一种新型的基于LAMP技术的DNA等温扩增技术，具有高灵敏度、高特异性、快速简单等优势，无需复杂、昂贵的热循环仪器和后放大步骤，最低灵敏度达到4个拷贝/反应。但该技术也有缺点，在检验过程中要设计的引物比较多，操作过程也比较繁琐，沉淀的可视化难度较高，特别是在目标DNA的含量较少以及存在较高的相互影响情况下，会影响到检验结果。

4.数字PCR技术。数字PCR技术（DPCR）是最近20年出现的第三代PCR技术，这是一种基于常规PCR原理与Poisson统计分布相结合的新型PCR技术。唐廷廷团队以羊和牛单拷贝的生长激素GH为特异的基因，设计了特异的引物和探针，利用液滴型DPCR技术对羊和牛单拷贝中的鸭源成分进行了分析，并将牛单拷贝的数量与牛单拷贝的重量进行了直线相关分析，从而完成了对牛单拷贝中的“鸭”来源成分的测定。胡悦团队利用羊肉和猪肉的单拷贝DNA序列设计了引物和探针，用来证实DNA的浓度和数量与肉类品质有一定的相关性，从而确定肉品中的猪源和羊源物质的数量，并确定肉类品质。

总而言之，数字PCR技术具有较高的特异性、灵敏度，在较短的时间内其检出下限可达复制数量级。但是，这种方法比较繁琐，所需的设备和探头也比较昂贵。

5.限制性片段长度多态性方法。限制性片段长度多态性方法（PCR-RFLP）技术是通过对基因进行酶切，将基因序列进行剪切，得到相应的基因序列。PCR-RFLP以其低成本、高灵敏度、高通量、适用面广的优势已经成为当前最为高效的一种技术。Kumar等人借助PCR-RFLP技术，利用一对特异性的引物对5个常用的可食肉类进行了分析，以 AluI、TaqI为靶标，分别对不同条件下的水牛、羊肉、猪肉等样品进行了检测。TaqI的特异性酶解反应可获得4个长度分别为43bp、131bp、163bp和272bp的序列，其特异性的酶解反应可用于5种可食动物，但所需时间较多，需24h。Mahajan等人利用 MT 12S rRNA作为标记，通过对水牛、绵羊等多种肉的分析表明，单靠Alu I的酶解作用难以将羊与羊区分，而联合应用两种酶解作用后能将两者分开。在羊的BspTI的酶解物中，发现了3233bp和133bp的两个碱基段，而在羊肉的酶解物中没有发现这种剪切体。

总之，PCR-RFLP技术在牛/水牛和绵羊/山羊等近缘种中，可实现高精度、高特异性和低成本的分子标记。但是，这种方法比较耗时耗力，并不适用于肉类掺假的现场检验。

三、基于PCR技术的羊肉成分检测方法对比

在测试期间，研究者们采用了不同的方法来检测掺假羊肉，每个方法都有利弊。常规PCR法具有简便、特异性好、检出少量掺假的特点，但是其检出数目无法准确定位，并且有污染风险。实时荧光定量PCR可以检出掺杂的种类和含量，在封闭的试管内进行，还可以减少被污染的几率，但是所需的设备很贵，而且对试验的条件也很苛刻。环介导等温扩增技术不需要任何贵重的设备，只需要水浴，大约40min就可以进行检验，所需的时间短，而且对试验条件和设备没有较为苛刻的条件，还可以在反应的混合物中添加SYBR绿色染色剂来进行LAMP的检验，但是过程中沉淀的可视化难度较高，所需要的引物的设计和选择也会比较繁琐。基于其品质与DNA复制数量的直线相关，数字PCR可以准确地探测出肉中掺入杂质的复制数量，具有很高的专一性、灵敏度和较少的时间，但是对试验的操作有很高的要求，并且实验过程非常繁琐。限制性片段长度多态性法具有灵敏度高、特异性强、成本低廉等优点，但存在耗时长等缺点。

综上，鉴于现有的肉类掺假检测技术都有各自的优缺点，未来随着检测技术的不断进步，亟需建立快速、低成本、高灵敏度的检测方法，进而保障羊肉及其他肉类中肉源的质量安全。

作者简介：李艾泽（1990-），女，蒙古族，内蒙古乌兰浩特人，中级工程师，硕士研究生，研究方向为食品质量与安全。