不同处理中间锦鸡儿引发柠条种子小蜂行为反应及其挥发物成分分析

胡雅茹，张燕如*，姜海燕*，赵胜国，雷静文，王晓丽

（1.内蒙古农业大学 林学院，内蒙古 呼和浩特 010019；2.内蒙古自治区林业和草原有害生物防治检疫总站，内蒙古 呼和浩特 010020）

中间锦鸡儿（Caragana liouana）属豆科（Fabaceae）锦鸡儿属（Caragana），是旱生落叶灌木。分布于中国宁夏、内蒙古、山西、陕西等地，天然分布于草原地带，生长于半固定和固定沙地、黄土丘陵，在草原及荒漠草原地带的固定沙丘或平坦沙地上形成建群种，在中国干旱、半干旱地区脆弱生态系统植被恢复中发挥着十分重要的作用［1］。柠条种子小蜂（Bruchophagus neocaraganae），又名锦鸡儿广肩小蜂和柠条广肩小蜂，属膜翅目（Hymenoptera）广肩小蜂科（Eurytomidae），是我国林业危险性有害生物［2］，取食中间锦鸡儿种仁，严重影响种子的形成［3-4］。在我国，主要对柠条种子小蜂的形态、危害特点、生活习性、田间种群消长规律以及种群动态方面进行研究报道［4-7］，目前对柠条种子小蜂的防治主要以化学防治为主，但长期使用化学药剂会对生态造成严重破坏，还会带来农药残留以及柠条种子小蜂产生抗药性的问题，且柠条种子小蜂幼虫位于中间锦鸡儿豆荚中，体型小、危害隐蔽，常规的化学防治难以防治到位，而引诱剂或趋避剂防控技术具有高效无毒、针对性强、诱剂引诱力大、不伤天敌等优点，克服了传统农药防控和灯光诱杀的局限，应用前景广阔［8］，故研究柠条种子小蜂的绿色防控技术显得尤为重要。

植物挥发性有机物（VOCs），是植物次生代谢产物的一部分［9］，VOCs 影响着昆虫的多种行为反应，包括昆虫对寄主植物的定向和趋性行为、逃避行为、刺激昆虫取食、引诱昆虫选择产卵场所以及防御害虫等［10］，健康植株与受植食性昆虫取食后的植株的挥发物在质和量上有很大差异［11］，植物在受到植食性昆虫取食危害时产生有别于健康时期的挥发物叫做虫害诱导植物挥发物（herbivore-induced plant volatiles，HIPVs）［12］，HIPVs对一些害虫的寄主选择、产卵、迁移、取食、交配等行为产生直接影响［13］，这在植物抵御外来侵害中发挥重要作用［14-15］。目前，大多数研究集中在植物挥发物在植物-害虫-天敌三者关系中的变化［16-17］，而关于同种或异种昆虫对植物挥发物的影响研究也越来越引起人们的重视，如海灰翅夜蛾（Spodoptera littoralis）雌性成虫喜欢在被同种幼虫取食过的美洲棉（Gossypium hirsutum）上产卵［18］，象鼻虫（Anthonomus eugenii）更趋向于在被同类侵害的辣椒树上取食［19］，研究同种昆虫对植物挥发物的影响对于了解和掌握害虫与植物之间的关系具有重要意义。

本研究采用“Y”型嗅觉仪测定了柠条种子小蜂对3 种不同处理的中间锦鸡儿挥发性物质的趋性行为反应，采用动态顶空收集装置收集了3 种不同处理的中间锦鸡儿植株挥发物，利用气相色谱—质谱联用技术 （GC-MS） 对挥发物进行定性和相对定量分析，并采用“Y”型嗅觉仪测定柠条种子小蜂对其中挥发物单体的趋性行为反应，以期初步筛选对中间锦鸡儿成虫具有引诱或趋避作用的挥发物，为柠条种子小蜂植物源引诱或趋避剂的开发和应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试昆虫

柠条种子小蜂幼虫采集时间为2021 年6 月，采集地点为内蒙古自治区呼和浩特市乌素图国家森林公园（40°51'14"N， 111°34'33"E），带回试验室（室内（27±1） ℃、L∶D=14 h∶10 h）放入养虫笼（30 cm×30 cm×60 cm）内饲养，保持相对湿度70%±10%，待羽化后进行雌雄配对，获得待产雌虫用于接虫试验。

1.1.2 供试植物

中间锦鸡儿位于内蒙古自治区呼和浩特市乌素图国家森林公园柠条林，为了防止其他害虫对接虫植株的影响，于冬季害虫未活动时用细密的网纱罩住植株，花期取下网纱，让花自然授粉，待结出嫩果后立即用网纱罩住，以获得健康的中间锦鸡儿36株。中间锦鸡儿嫩果期进行野外接虫，接虫比例为50%，通过观察到柠条种子小蜂在果荚上取食或产卵来确定中间锦鸡儿被害，共接种12 株植株，6 株用于行为实验，6 株用于植物挥发物采集试验。在挥发物收集24 h 前，用75%乙醇清洗过的刀片在健康植株的果荚上割0.5 cm 的切口，并在挥发物提取之前再损伤一次［20］，以获得机械损伤果枝，受伤率为50%，共破坏 12 株植株，6 株用于行为试验，6 株用于植物挥发物采集试验。为防止植株过近导致挥发物测量有误差，健康、虫害以及机械损伤植株株体分布间隔3～5 m。

1.1.3 供试试剂

色谱纯正己烷，上海安谱科学仪器有限公司，根据收集到的植株主要成分及成分比例大的有且可购买到的供试挥发性气味物质的标准化合物见表1 。

表1 不同处理下中间锦鸡儿挥发性成分的相对含量Table1 Relative contents of volatiles from C. liouana plants under different treatments

1.2 试验方法

1.2.1 柠条种子小蜂对中间锦鸡儿的嗅觉行为反应

“Y”形嗅觉仪的玻璃管（直径：3 cm；单臂长：15cm；选择臂长：10 cm）连接到2 个味源瓶。气流流速1 L·min-1，通过大气采样仪（QC-1 型，北京市劳动保护科学研究所）控制，气流通过活性炭过滤、洗气瓶湿润，然后通过装有气味源的味源瓶和“Y”形管到达被试虫体的入口处，在放入被试虫体前先开通气流10 min，保证气味扩散到选择臂中。测试室内光线均匀（利用白炽灯模拟阳光），温度23～25 ℃，相对湿度50%～60%，试验时间为9：00-17：00，该时间段均属于柠条种子小蜂活跃期，随机选择一头成虫放在Y 管的入口处，2 个选择臂分别是待测果枝和洁净的空气。每个成虫观察时间最多10 min，超过选择臂5 cm 处，被认为做出选择，其它情况被认为没有做出选择。每个气味源测试30 头雌虫，每测试5 头虫体后调换两臂，重复6 次，所有供试成虫只使用1 次。更换气味源时整个装置在洗涤剂溶液中清洗，并用75%乙醇冲洗，然后在120 ℃烘箱中烘干。

1.2.2 挥发物的采集

采用动态顶空吸附法釆集植株枝叶的挥发物。将植株枝条套入密闭的聚四氟乙稀烤鸡袋中，将袋内的空气利用大气釆样仪（QC-1 型，北京市劳动保护科学研究所）抽空后充入经活性炭过滤的干净空气，密闭整个系统进行循环采集活体植物挥发物，将挥发物吸附在含有100 mg 的Paropak Q（80～100目，Waters，美国）的自制吸附管（内径：0.7 cm，长10 cm）中，采集装置的连接管为聚四氟乙烯管（内径0.6 cm，外径0.8 cm），釆气流量 500 mL·min-1，采集过程确保在无损伤植株状态下进行，装置具体情况如图1。分别收集健康植株、虫害植株和机械损伤植株的挥发物，每种处理的植物在相同时间段内重复釆集6 株，同时以空袋采集空气作为对照试验。每个样品连续收集4 h。采样结束后，用500 μL 正己烷淋洗吸附柱，在氮吹仪下浓缩至1/10 后密封放入-20℃冰箱中保存。

图1 动态顶空收集装置Fig. 1 Dynamic headspace collection device

1.2.3 挥发物的鉴定

将保存的浓缩液于气相色谱—质谱联用仪（GC-MC，Agilent Technologies）中进行分析。

GC 工作条件：色谱柱为DB-5 柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm，Agilent Technologies，Santa Clara，CA）；程序升温：开始温度40 ℃，保持2 min 后以每分钟4 ℃的速度升至160 ℃，后以每分钟20℃的速率升温到270 ℃，保持3 min。进样量1 μL，不分流进样。

MC 工作条件：接口温度250 ℃ ；四级杆温度为150 ℃；离子源温度220 ℃；电子源为EI 源；电子能为70 ev；扫描质核比范围29～60 amu。发射电流150 μA，全扫描模式，每次扫描0.2 s。用 Turbo Mass 5.4.2 软件（PerkinElmer，Waltham，MA）进行数据分析，根据色谱保留时间和质谱数据与Standards and Technology Mass Spectral（NIST）中数据库进行对比，并且通过标准品进一步验证。利用总离子流峰面积归一化法，计算挥发物组分的相对含量，去除空气中的杂质得到试验结果。

1.2.4 柠条种子小蜂对植株挥发物的嗅觉行为反应

装置连接方式同1.2.1。将10 μL 刺激样品滴在3 cm×3 mm 的滤纸条上，放入味源瓶中，用色谱纯级的正己烷作为空白对照。每种化合物每次测试30 头雌虫，每测试5 头虫体后调换两臂，重复6次，所有供试成虫只使用一次。更换气味源时整个装置在洗涤剂溶液中清洗，并用75%乙醇冲洗，然后在120 ℃烘箱中烘干。

1.3 统计分析

使用卡方检验分析行为反应测试结果。采用单因素方差分析以及Duncan 多重比较法分析不同处理下的植物挥发物相对含量之间的差异显著性以及各组间的配对比较，差异显著水平为P＜0.05。采用独立样本t 检验分析两两处理方式挥发物相对含量之间的差异显著性，差异显著水平为P＜0.05。使用统计软件SPSS 25.0 进行数据分析。使用Origin 2019 软件对3 种处理的植物挥发物成分进行主成分分析。

2 结果与分析

2.1 柠条种子小蜂对3 种处理中间锦鸡儿的选择

柠条种子小蜂对中间锦鸡儿不同处理挥发物的嗅觉反应结果如图2 所示，Y 型嗅觉仪测定表明，健康的中间锦鸡儿挥发物对柠条种子小蜂产生显著的引诱作用（P＜0.05），受柠条种子小蜂危害的中间锦鸡儿对柠条种子小蜂产生显著的趋避作用（P＜0.05），而机械损伤的中间锦鸡儿挥发物对柠条种子小蜂无明显引诱或趋避作用（P＞0.05）。

图2 柠条种子小蜂对3种处理中间锦鸡儿的嗅觉选择偏好性Fig.2 Olfactory selective preferences of B. neocaraganae to three treatments of C. liouana

2.2 3 种处理中间锦鸡儿挥发物分析

机械损伤和柠条种子小蜂危害对中间锦鸡儿挥发物的种类具有一定的影响。3 种处理的中间锦鸡儿释放的挥发物中共鉴定出35 种化合物，其中健康中间锦鸡儿释放的挥发物中鉴定出22 种化合物；受机械损伤释放的挥发物鉴定出27 种化合物；柠条种子小蜂危害后植株挥发物鉴定出31 种化合物，化合物大多数为萜烯类化合物，另外还有少量酯类、醇类、酮类、醛类、烷烃和烯烃化合物（表1）。

试验结果表明，不同的损伤方式对中间锦鸡儿挥发物大部分组分与相对含量具有显著影响（表1）。与健康中间锦鸡儿相比，受虫害的中间锦鸡儿植株挥发物中增加了3-蒈烯、α-蒎烯、α-香柠檬、β-波旁烯、β-石竹烯、γ-戊内酯、桉叶油醇、二十五烷、三十一烷、正十六烷、正十四烷和紫苏烯，在健康植株挥发物中检测到了水杨酸甲酯、顺-3-己烯醇和环癸醇，而这些化合物并未在虫害植株中检测到；（+）-柠檬烯、β-松油烯、月桂烯在虫害植株挥发物中的相对含量显著高于健康植株中的相对含量（F= 2.407，df =10，P=0.000；F= 1.519，df =10，P=0.110；F=2.990，df =10，P=0.000）。

与健康中间锦鸡儿相比，受机械损伤的中间锦鸡儿植株挥发物中增加了α-香柠檬、γ-戊内酯、对乙基苯甲醛、二十五烷、三十一烷、正十四烷、正十六烷和紫苏烯，在健康植株挥发物中检测到了反-3-己烯醇、罗勒烯和水杨酸甲酯，而这些化合物并未在机械损伤植株中检测到。（+）-柠檬烯、β-松油烯、二十七烷、柠檬烯、正壬烷在机械损伤植株挥发物中的相对含量显著高于健康植株中的相对含量（F= 0.196，df =10，P=0.000；F= 7.405，df =10，P=0.000；F= 10.115，df =10，P=0.000；F= 0.400，df =10，P=0.001；F= 11.299，df =10，P=0.001）。

与机械损伤中间锦鸡儿相比，受虫害的中间锦鸡儿植株挥发物中增加了3-蒈烯、α-蒎烯、β-波旁烯、β-石竹烯、反-3-己烯醇、桉叶油醇和罗勒烯，在机械损伤植株挥发物中检测到了对乙基苯甲醛、环癸醇和顺-3-己烯醇，而这些化合物并未在虫害植株中检测到；β-松油烯、邻苯二甲酸二丁酯、月桂烯在虫害植株挥发物中的相对含量显著高于机械损伤植株中的相对含量（F= 3.303，df =10，P=0.000；F= 0.771，df =10，P=0.110；F=2.240，df =10，P=0.000）。

主成分分析中，如图3 所示，水平轴对总挥发物的解释率为66.8%，垂直轴的解释率为22.8%，健康植株、虫害植株和机械损伤植株分别被分到不同的象限。第一象限中有虫害植株，其中的物质中，3-蒈烯、α-蒎烯、β-波旁烯、β-石竹烯、桉叶油醇、对乙基苯乙酮和月桂烯与虫害植株相关性较大。第二象限为健康植株，其中水杨酸甲酯与健康植株的分布最近，是健康植株的主要成分。位于第三象限的是机械损伤植株，对乙基苯甲醛和6-乙基-2-甲基癸烷有较大的正向影响。第四象限中没有植株分布，分布的成分中大部分偏向第一象限的虫害植株，而γ-戊内酯比较偏向第三象限的机械损伤植株。

图3 3 种处理下中间锦鸡儿植株挥发物成分PCA 分析Fig. 3 PCA analysis of volatile components of C. liouana plants under three treatments

2.3 柠条种子小蜂对中间锦鸡儿挥发物的行为反应

以能够从北京百灵威科技有限公司购买到的8个植株主要成分及成分比例大的水杨酸甲酯、反-3-己烯醇、柠檬烯、3-蒈烯、β-石竹烯、月桂烯、对乙基苯甲醛和γ-戊内酯，进行行为反应测试。结果显示水杨酸甲酯、反-3-己烯醇和柠檬烯对柠条种子小蜂产生显著的吸引作用（P＜0.05），3-蒈烯和β-石竹烯对柠条种子小蜂产生显著的趋避作用（P＜0.05），月桂烯对柠条种子小蜂产生极显著的趋避作用（P＜0.01），柠条种子小蜂对对乙基苯甲醛和γ-戊内酯无明显的选择行为（P＞0.05；图4）。

图4 柠条种子小蜂对中间锦鸡儿挥发物组分的嗅觉选择偏好性Fig.4 Olfactory preferences of Bruchophagus neocaraganae for volatile fractions of the Caragana liouana

3 讨论

植物挥发物在植食性昆虫的生境定位，寄主或食物搜索等行为中起着重要作用［21］。本研究利用“Y”型嗅觉仪测定了柠条种子小蜂对3 种处理中间锦鸡儿的行为选择，结果表明健康的中间锦鸡儿对柠条种子小蜂具有明显的引诱作用，被柠条种子小蜂危害的中间锦鸡儿对柠条种子小蜂具有明显的趋避作用，机械损伤的中间锦鸡儿对柠条种子小蜂无显著引诱或趋避作用，这说明植食性昆虫对被同种昆虫危害的植物的取食选择性降低。一些研究表明，被昆虫取食后植物化合物的释放会改变昆虫的行为和群落组成［22-23］。植食性昆虫对被同种昆虫危害的植物的取食选择性和产卵选择性下降，如：利马豆（Phaseolus lunatus）在遭受叶螨（Tetranychus urticae）的取食行为后释放的挥发物对叶螨产生趋避作用［24］；被甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）危害后的玉米叶片会排斥甜菜夜蛾的进一步危害［25］；被天蛾（Manduca）幼虫取食过的植物释放的挥发物会降低其成虫在上面的产卵量［26］。

昆虫的危害会改变植物释放的挥发性物质［27］，为确定具体是哪些挥发性物质在柠条种子小蜂定位的过程中发挥作用，本研究对不同处理中间锦鸡儿挥发物进行了GC-MS 分析，共鉴定出35 种化合物，这些化合物主要为萜烯类、酯类、醇类、酮类、醛类、烷烃和烯烃类。不同处理中间锦鸡儿的挥发物种类组成和相对含量存在一定差异。有研究表明，不论害虫种类，幼虫危害植物释放的挥发性物质均比未受害植物释放的挥发物含量丰富，但其排放强度因危害种类而异［28］，同样的，本文中被柠条种子小蜂危害的中间锦鸡儿挥发物成分较健康中间锦鸡儿和机械损伤中间锦鸡儿成分丰富，推测是昆虫的危害刺激植株释放特殊挥发物。根据挥发物成分产生方式的不同，HIPVs 可分为新形成的化合物、诱导合成的化合物和植物本身的化合物［29］。本研究发现，中间锦鸡儿在遭受机械损伤和柠条种子小蜂危害后释放了一些新的化合物，与健康植株相比较，机械损伤后植株挥发物成分中新出现了对乙基苯甲醛，以及机械损伤和虫害植株均有的α-香柠檬，γ-戊内酯，二十五烷，三十一烷，正十四烷，正十六烷和紫苏烯，这些化合物在受损后释放，而柠条种子小蜂的取食也会造成植株的机械损伤，表明这些化合物是新形成的化合物，（+）-柠檬烯、β-松油烯、二十七烷、柠檬烯、正壬烷在机械损伤植株挥发物中的相对含量显著高于健康植株中的相对含量，有研究表明，人工切割能使植物释放比未受到破坏时更高浓度的挥发性有机物［30］。植物在遭受植食性昆虫攻击后，所释放的挥发物无论是在种类方面还是在数量方面都将发生明显的变化［31］。与健康植株以及机械损伤植株相比较，虫害后植株挥发物成分中新出现了3-蒈烯、α-蒎烯、β-波旁烯、β-石竹烯、桉叶油醇，这些化合物是植株受到柠条种子小蜂口腔唾液或产卵等刺激诱导后出现的，表明这些化合物是诱导合成的化合物。中间锦鸡儿受虫害后，挥发性化合物（+）-柠檬烯、β-松油烯、月桂烯的相对含量在受损后显著增加，表明这些化合物为植物本身的化合物。

根据主成分分析，第一象限中与虫害植株相关性较大的3-蒈烯、α-蒎烯、β-波旁烯、β-石竹烯、桉叶油醇、对乙基苯乙酮和月桂烯可能参与对柠条种子小蜂的趋避作用，第二象限中健康植株的主要成分水杨酸甲酯可能与吸引柠条种子小蜂有关，与健康植株较为接近的罗勒烯和乙酸己四烯酯可能也参与柠条种子小蜂的吸引。Sun 等［32］利用Y形管发现罗勒烯和乙酸叶醇酯对茶丽纹象甲（Myllocerinus aurolineatus）具有吸引作用；水杨酸甲酯和6-甲基-5-庚烯-2-酮对红火蚁（Solenopsis invicta）有显著的引诱效果［33］，水杨酸甲酯是棉蚜（Aphis gossypii）危害后棉花新产生的植物挥发物，而红火蚁更偏向受棉蚜危害的棉花，水杨酸甲酯可能在此过程起到一定作用。在本文中，水杨酸甲酯是健康中间锦鸡儿产生的挥发物，柠条种子小蜂更倾向于健康中间锦鸡儿，可能受水杨酸甲酯的影响。但是不同昆虫对物质浓度的敏感度不同，不排除同一物质在不同浓度下对昆虫产生的影响不同。柠条绿虎天牛（Chlorophorus caragana）对低浓度化合物反应较小，而对高浓度化合物反应较为明显［34］；松阿扁叶蜂（Acantholyda posticalis）成虫对柠檬烯反应强度与化合物的剂量成正相关［35］。吸引植食性昆虫的化合物剂量也有所不同，低剂量的β-石竹烯对斑翅果蝇（Drosophila suzukii）具有引诱效果，高剂量的β-石竹烯对其具有驱避效果［36］。有时，吸引植食性昆虫需要的不是单个化合物，而是HIPV 的混合物［37］，单独呈现的（E）-b-法尼烯不会引起寄生蜂（Chrysonotomyia ruforum）的任何行为反应，而当呈现在健康松树气味的背景下时，会吸引此寄生蜂［38］。在本文中，水杨酸甲酯、反-3-己烯醇和柠檬烯对柠条种子小蜂的吸引作用以及3-蒈烯和β-石竹烯对柠条种子小蜂趋避作用是否与其浓度或剂量有关，是否是多个化合物或者是不同浓度不同剂量的化合物对柠条种子小蜂产生作用还有待研究。

4 结论

本研究通过对3 种处理中间锦鸡儿挥发物对柠条种子小蜂成虫的嗅觉行为反应、对中间锦鸡儿挥发物进行GC-MS 分析以及柠条种子小蜂对挥发物单体的行为反应，结合挥发物成分分析、主成分分析以及行为试验，证明健康中间锦鸡儿对柠条种子小蜂有吸引作用，被柠条种子小蜂危害的中间锦鸡儿对柠条种子小蜂有趋避作用，反-3-己烯醇、柠檬烯和水杨酸甲酯对柠条种子小蜂产生吸引作用，3-蒈烯、β-石竹烯和月桂烯对柠条种子小蜂产生趋避作用，柠条种子小蜂对乙基苯甲醛和γ-戊内酯无明显的选择行为。研究结果对揭示柠条种子小蜂与其寄主植物中间锦鸡儿的相互关系具有重要意义。也为柠条种子小蜂植物源引诱剂或趋避剂的开发和应用提供了一定的理论基础。