RUNX2基因多态性与中国北方汉族青少年特发性脊柱侧凸的关联性研究

吴增玉，张跃川，彭越，吴南，邱贵兴，庄乾宇，仉建国

青少年特发性脊柱侧凸（adolescent idiopathic scoliosis,AIS）是一种发生在10～18 岁的病因不明的脊柱三维结构畸形，总体患病率约为0.47%[1-3]。目前虽然对AIS的临床治疗取得了较大进展，但其确切病因仍不清楚。以往的研究表明，遗传多态性在AIS的发病机制中起关键作用。最近的全基因组关联分析（genome wide association study,GWAS）和其他研究已确定几种易感基因变异，例如GPR126、LBX1、PAX1等[4-6]。RUNX2 是骨和软骨发育和分化重要的转录调控因子，RNA 和蛋白质分析表明，在AIS 松质骨中，RUNX2 水平较低[7]。RUNX2 在AIS 患者中的异常表达和骨密度降低表明其成骨细胞分化的异常调节，推测RUNX2 可能在AIS 患者骨密度降低的发病机制中起重要作用[8]。因此，本研究将RUNX2作为AIS的候选基因进行进一步研究。研究表明，RUNX2中的rs1321075 和rs1406846 与后纵韧带骨化和黄韧带骨化有关[9-12]，这与AIS 患者骨化异常存在相似之处，故将其选择与AIS进行关联研究。

AIS 是一种异质性极大的疾病，如果将AIS 患者作为一个单一的群体进行研究，就会产生假阳性或者假阴性的结果，因此本研究采取了分层研究的方法。AIS 主要有King、Lenke、PUMC（协和）分型3 种分型系统。邱勇等[13]对3 种分型系统的可信度和可重复性进行比较，证明了PUMC（协和）分型包括脊柱侧凸在三维平面内的畸形特点，分型全面，易于掌握，而且具有很好的可信度和可重复性，适合脊柱侧凸的三维矫形。PUMC（协和）分型系统将AIS 分为单弯（Ⅰ）、双弯（Ⅱ）或三弯（Ⅲ）[4]，它是一种三维分型系统，使用相对简单，并有相应的推荐手术方式。

文献检索显示，在中国北方汉族人群中，尚无RUNX2基因多态性与AIS 的关联分析研究。识别与RUNX2基因多态性相关的AIS特定亚组具有重要意义。本研究假设RUNX2风险单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism,SNP）可能与AIS PUMC（协和）分型系统相关，并对其相关性进行初步研究。因此，本研究招募了来自中国北方汉族人群和相应对照的队列进行病例对照研究。对RUNX2中的SNP进行基因分型，随后基于其PUMC（协和）分型进行表型关联分析。

1 资料与方法

1.1 一般资料

AIS 组患者的纳入标准：①诊断为AIS 且Cobb角＞20°的患者；②发病年龄10～18 岁；③使用Native Place 问卷确定的来自中国北方汉族人群的患者；④影像资料完整的患者，包括X 线、CT 或脊柱MRI检查。排除标准：①已知病因为继发的脊柱侧凸患者，包括先天性脊柱侧凸、神经肌肉性脊柱侧凸、继发于骨骼发育不良和结缔组织异常的脊柱侧凸；②非中国北方汉族人群；③影像资料不完整者；④患有影响骨骼发育的慢性疾病的患者。

健康对照组纳入标准：①年龄10～18 岁；②使用Native Place 问卷确定的来自中国北方汉族人群；③双肩高度、弯腰试验、脊柱X 线检查和家族史均正常。

根据PUMC（协和）分型系统，所有患者均由至少两名经验丰富的脊柱外科医师分为三类。所有健康对照组受试者均由一名以上的脊柱外科医师进行评估。

本研究选择在北京协和医院就诊的北方汉族患者。2017年12月至2021年12月，共有来自中国北方汉族人群的97 例诊断为AIS 的患者和100 名健康对照受试者在“系统解析脊柱侧凸及合并症协作组”研究中入组。

本研究经中国医学科学院北京协和医院伦理委员会审批通过（审批号：JS-3403），并从所有参与者或其父母处获得签署的知情同意书。

1.2 样本收集

AIS 组与健康对照组均于空腹时一次性抽取外周静脉血2 mL 于乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA）抗凝管中，-80℃保存。血样在24 h 内进行处理、标记、登记、冻存。由专人负责将临床资料、一般情况等数据录入。

1.3 研究方法

采用常规的酚/氯仿提取法提取基因组DNA，并溶于TE 缓冲液中，获得的基因组DNA 采用Nano Drop 测得光密度（optical density,OD）值和浓度，-20℃保存备用。样品采用全基因组测序方法对SNP位点进行检测分型，所有测序工作均由华大基因公司（中国）完成。

1.4 统计学方法

采用SPSS 25.0软件对临床资料和实验结果进行各项统计检验，包括样本的一般统计检验、Hardy Weinberg遗传平衡检验、等位基因-疾病关联研究、基因型-疾病关联研究和基因型-表型［性别和PUMC（协和）分型］关联研究。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

AIS 组和健康对照组在rs1321075 位点的基因型TT 相比，差异有统计学意义（P=0.003），而两组的等位基因频率比较差异无统计学意义（P=0.866）。AIS组rs1406846 等位基因、基因型与健康对照组相比差异均无统计学意义（P=0.196，P=0.252）。见表1。

表1 基因分型筛查及位点关联分析结果（个数）

两位点在AIS 组中的基因型分布与患者的性别无关（P=0.366，P=0.774）。rs1321075 位点在AIS 组中的基因型分布与PUMC（协和）分型相关（P=0.011），它的基因型G/G+T/G 与PUMCⅢ型相关。见表2。

表2 AIS患者的基因型-表型关联分析结果（个数）

AIS 组与健康对照组rs1321075 位点在共显性、隐性和超显性遗传模式下比较，差异均有统计学意义（P＜0.05，表3、4）。两组rs1406846 位点在各种遗传模式下比较，差异均无统计学意义（P＞0.05，表5、6）。

表3 rs1321075关联分析（n=197）

表4 rs1321075关联分析（n=197，调整性别变量后）

表5 rs1406846关联分析（n=197）

表6 rs1406846关联分析（n=197，调整性别变量后）

3 讨论

3.1 研究主要结果总结

本研究调查了中国北方汉族人群中RUNX2基因中2 个SNP 位点（rs1321075、rs1406846）与AIS 的关联，发现rs1321075不仅有助于AIS易感性，而且还与不同类型的AIS相关。

本研究验证了RUNX2基因多态性可能在AIS 发病机制中发挥重要作用的假设，这是迄今为止中国北方汉族人群中最大的散发性AIS 队列。选择RUNX2基因中的2 个SNP，次要等位基因频率大于0.05，被选为关联分析的标记。

RUNX2基因的2 个SNP 都进行了基因分型，并且在健康对照组中处于Hardy-Weinberg平衡状态，但AIS 组中则没有。这种现象提供了RUNX2基因与AIS之间疾病关联的证据。

rs1321075 是RUNX2的内含子SNP，研究发现其与中国汉族人群中的后纵韧带骨化和黄韧带骨化相关[9]。本研究中临床表型分析发现，rs1321075 TT 基因型和健康对照组相比，差异有统计学意义（P=0.003）；该位点在AIS 组中的G/G+T/G 基因型分布经分层分析发现，与PUMCⅢ型相关（P=0.011），若患者临床早期基因检测结果为该基因型，则提示有可能会进展为PUMCⅢ型。因此，AIS 患者在基因的多个环节可能存在不同程度的问题，这可能进一步从理论层面解释患者疾病虽然有所相同，但却会存在不同严重程度的畸形，即遗传异质性。未来需要更多样本量的研究来确定rs1321075与PUMC（协和）分型其他亚组之间的关系。

rs1406846 被确定与股骨长度相关[12]，位于RUNX2的内含子区域。内含子一度被认为是无效片段或垃圾基因，但Parenteau 等[14]通过对酵母进行转录组学和遗传分析发现，内含子通过对核糖体蛋白基因的抑制来促进对饥饿的抵抗，这可能有助于解释内含子在基因中的进化保存，因此内含子应当引起重视和研究。RUNX2上多态性位点rs1406846 可能调节后纵韧带骨化的严重程度[11]。但本研究发现，AIS 患者的rs1406846 等位基因和基因型与健康对照组相比差异无统计学意义。

3.2 RUNX2基因的影响及作用

RUNX2位于6p21.1，由10个外显子组成，该基因的上述突变和其他突变与颅骨锁骨发育不良（cleidocranial dysplasia,CCD）有关[15-17]。Kamamoto等[18]对1例临床上诊断患有CCD的患者进行研究，通过对RUNX2基因进行的突变分析，确定了一个新的移码突变，它产生了一个突变体RUNX2。Otto 等[19]使用lacZ 报告基因对小鼠胚胎RUNX2 表达的分析显示，在骨化的早期阶段之前，RUNX2在骨形成部位强烈表达。因此，RUNX2基因对成骨细胞分化和骨形成至关重要。

3.3 本研究的局限性

本研究属于回顾性病例对照研究，可调查多个因素与疾病的联系，但不可避免存在一些不足之处，即该方法得出的结果是相关性，在未来的研究中，需要结合细胞和模式动物进一步验证其因果关系。除此之外，本研究主要研究对象为中国北方汉族人群，对于其他种族或国家仍需要进一步研究。

4 结论

综上所述，RUNX2rs1321075 TT 基因型和健康对照组相比，差异有显著统计学意义，即该位点TT基因型可能会促进AIS的发生和发展，基因型G/G+T/G与PUMC Ⅲ型患者的发病相关，上述结果表明RUNX2基因可能有助于中国北方汉族人群的AIS 易感性，尤其与PUMC Ⅲ型患者的发病密切相关。这有助于进一步了解AIS的发生和发展，相信在未来不久随着基因测序价格的降低和普及，将为临床诊断及预测疾病进展的可能性或可能的PUMC（协和）分型提供更多的判断依据。

【利益冲突】所有作者均声明不存在利益冲突