基于网络药理学和分子对接技术探讨祛湿化痰方治疗冠心病的作用机制

侯时昭,许文静,蓝涛华,吕渭辉

冠心病(coronary heart disease,CHD)是全球最为常见的慢性病之一,《中国心血管病报告2018》[1]指出,目前我国有1 100万例冠心病病人,心血管病死亡率居首位,早在2014年我国内地冠心病病人应用经皮冠状动脉介入术(percutaneous coronary intervention,PCI)治疗已超过50万例,但有研究发现,仍有50%以上经PCI术治疗的病人出现心绞痛症状缠绵不愈的情况[2],而针对这种情况现代医学尚未有明确的办法予以改善。

祛湿化痰方是根据陈可冀院士多年医治冠心病的临床经验总结而成,对心绞痛具有较好的临床疗效,全方以不换金正气散及二陈汤为基础,以“湿损血络”为病机核心,主治胸痹心痛之湿证。本研究拟使用Hopkins提出的集合数据库检索、数据挖掘、靶点预测及模拟实验室等多种研究手段,并结合中药成分与靶点的分子对接构象,多角度分析中药成分-靶点间的相互联系和作用,期望凭借网络药理学分析方法研究祛湿化痰方治疗冠心病的分子机制及生物通路机制。

1 资料与方法

1.1 祛湿化痰方的主要化学成分及作用靶点 通过中药系统药理学分析平台(TCMSP)检索祛湿化痰方中的每味药物及其相应的有效成分及作用靶点,以口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%、类药性(drug-likeness, DL)≥0.18作为基础阈值来筛选,筛查出祛湿化痰方的主要作用靶点和化学成分。

1.2 祛湿化痰方的药物作用靶点与冠心病的相关基因靶点的交集分析 应用GeneCards(https://www.genecards.org/)和OMIM(http://omim.org)数据库检索冠心病的相关基因。检索时将关键词设定为“冠心病(coronary heart disease)”,再将两个数据库中找到的基因进行合并,剔除重复内容,最终得出冠心病相关的基因靶点。结合祛湿化痰方中的药物作用靶点,运用Venny软件绘制祛湿化痰方治疗冠心病的交集靶点韦恩图。

1.3 构建蛋白质互作网络(protein-protein interaction, PPI) 利用Cytoscape 3.7.2软件进行网络拓扑学分析,并同步构建“祛湿化痰方-化合物-靶点-冠心病”的网络图。具体操作步骤:首先,在STRING(https://string-db.org/)数据库中导入祛湿化痰方治疗冠心病的交集靶点,以置信度大于0.9作为筛选条件,勾选“Multiple proteins”,将物种设定为“Homo sapiens”,构建出PPI网络图。然后,将STRING库中过滤出的基因靶点数据,运用CytoNCA插件,通过Closeness、Network、Degree等6种评分来筛选,筛选出最核心的基因蛋白交互靶点。

1.4 基因本体(GO)生物过程及京都基因和基因组百科全书(KEGG)信号通路富集分析 利用R语言程序分析祛湿化痰方治疗冠心病的交集基因靶点,设定以Q-value<0.05、P-value<0.05为基础阈值,完成GO生物过程以及KEGG通路富集分析。然后,选取GO生物过程分析中前10位以及KEGG信号通路富集分析中前30位,进一步做可视化处理。

1.5 分子对接分析 将最终筛选出来的核心基因对应的化合物的小分子配体2D结构通过PubChem网站下载,而其3D结构则应用Chemoffice软件转化,并最终得出mol2格式文件。核心基因对应的蛋白名称通过UniProt(https://www.uniprot.org/)翻译,而三维结构通过此名称从PDB蛋白数据库(http://www.rcsb.org/)中找出,并最终以pdb格式保存。将蛋白三维结构中的水分子及小分子配体使用PyMOL软件删除,仅保存蛋白受体三维结构。通过AutodockTools软件对蛋白受体进行加氢,计算电荷,将运算后的蛋白受体及小分子配体都以pdbqt格式文件保存,使用Grid Box设置蛋白受体的格点参数及坐标轴的大小,寻找小分子配体和蛋白受体的结合点。运用vina软件,以模型≤20个,结合能≤5.0 kJ/mol为阈值,得出相应的结合位点及结合能。最后,应用PyMOL软件进行可视化分析,绘制出分子对接构象图。

2 结 果

2.1 祛湿化痰方主要活性化合物成分及其基因靶标预测 运用TCMSP数据库,拟定DL≥0.18、OB≥30%为阈值,发现陈皮、苍术、半夏、莪术、石菖蒲、厚朴分别含有5个、9个、13个、3个、4个、2个活性化合物成分,整个复方合计36个祛湿化痰方主要活性化合物成分(见表1)。利用TCMSP数据库检索祛湿化痰方药物,排除重复后得到416个对应的潜在作用靶点,通过UniProt网站将其转换成对应的基因名称。

表1 祛湿化痰方活性化合物信息

2.2 筛选冠心病基因靶点 通过OMIM和GeneCards数据库,共筛选出7 264个与冠心病关联紧密的基因靶点。

2.3 祛湿化痰方与冠心病交集靶点 将416个药物潜在作用靶点及7 264个疾病基因靶点录入Venny软件,计算得出140个祛湿化痰方与冠心病的交集蛋白靶点,并绘制祛湿化痰方与冠心病交集靶点蛋白韦恩图。详见图1。

图1 祛湿化痰方与冠心病交集靶点蛋白的韦恩图

2.4 构建PPI网络

2.4.1 构建“祛湿化痰方-化合物-靶点-冠心病”交集网络 运用Cytoscape 3.7.2软件计算得出“祛湿化痰方-化合物-靶点-冠心病”交集网络。图中圆形节点代表药物化学成分,用不同颜色代表化合物来源,蓝绿色、蓝色、绿色、紫色、红色分别代表苍术、陈皮、莪术、厚朴、半夏。蓝色方形节点代表冠心病基因靶点,而基因靶点与药物化学成分的联系紧密程度与蓝色节点面积大小成正比;这两者的相互关系则使用连线来代表。详见图2。

图2 祛湿化痰方-主要成分-靶点-冠心病交集网络图

2.4.2 构建祛湿化痰方与冠心病共表达PPI网络图 绘制PPI网络图发现,共有118个基因蛋白靶点,连线表示蛋白相互作用关系,共826条。详见图3。

图3 共表达蛋白质互作网络图

2.4.3 筛选核心基因蛋白靶点 采用Cytoscape 3.7.2软件中CytoNCA插件,多重评分逐步过滤出雌激素受体α(ESR1)、丝裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)、JUN、丝裂原活化蛋白激酶3(MAPK3)、肿瘤蛋白p53(TP53)、蛋白激酶B1(AKT1)、丝裂原活化蛋白激酶14(MAPK14)共7个核心基因蛋白靶点。详见图4。

图4 核心基因靶点筛选

2.5 GO生物过程及KEGG信号通路富集分析

2.5.1 GO生物过程富集分析 GO生物过程富集分析是由分子功能(molecular function,MF)、细胞组成(cellular component,CC)和生物过程(biological process,BP)3个部分共同组成的。在MF方面,祛湿化痰方治疗冠心病与G蛋白偶联胺受体活性、转录因子活性、血红素结合、转录辅激活子结合、核受体活性等有关;在CC方面,祛湿化痰方治疗冠心病与细胞突触前膜及后膜的组成部分、细胞质囊泡腔、质膜小腔等有关;在BP方面,该治疗与氧化应激反应、对活性氧的反应、对脂多糖的反应、对营养水平的响应等有关。详见图5。

图5 GO生物过程富集分析图

2.5.2 KEGG信号通路富集分析 绘制KEGG信号通路气泡图(见图6)以及KEGG信号通路与核心基因靶点列表(见表2)。在KEGG通路富集分析结果中包括170条信号通路,可分为三大类别:①直接信号通路,包括雌激素信号通路、磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)-蛋白激酶B(AKT)信号通路、白细胞介素-17(IL-17)信号通路等;②感染相关通路,包括人巨细胞病毒感染、麻疹、弓形虫病等;③癌症相关通路,包括小细胞肺癌、前列腺癌、非小细胞肺癌等。这些信号通路与多种机制相关,包括细胞凋亡、Th17细胞分化、内分泌抵抗等。

图6 KEGG信号通路富集分析图

表2 KEGG信号通路与核心基因靶点

冠心病与PI3K-AKT、雌激素信号通路关系较为密切。因此,绘制相关通路图的时候采用这两条通路来进行分析,并将与本研究相关的基因蛋白靶点在通路图中标红来注明(见图7、图8)。如图所示,获得的核心基因蛋白靶点位于这两个信号通路中。因此可以推断,PI3K-AKT与雌激素信号通路与祛湿化痰方治疗冠心病的生物通路机制密切相关。

图7 雌激素信号通路图

图8 PI3K-Akt信号通路图

2.6 分子对接结果 分子对接需要受体和配体进行配对,本研究中受体正是核心基因蛋白,配体是作用于核心基因蛋白受体对应的小分子化合物。通过这两者的配对,列出核心基因与小分子化合物配体配对情况(见表3)。冠心病关联紧密的基因蛋白及相应的小分子化合物是通过文献检索获得,再进行分子对接,呈现出可视化的分子对接构象(见图9)。通过配对结果可知,结合能(≤-8.0 kJ/mol)较小的是ESR1、AKT1与柚皮苷(naringenin),MAPK14与汉黄芩素(wogonin)这两组。同时,他们之间的分子构象较为稳定。

图9 小分子化合物与基因蛋白分子对接构象

表3 核心基因与小分子化合物配对情况

3 讨 论

冠心病属中医学“卒心痛”“真心痛”“胸痹”“心痛”等病症范畴。“胸痹”病机在《金匮要略》一书中归纳为“阳微阴弦”,这一点在现代医家研究冠心病时被多次提及,成为一种公认的基本病机。然而在疾病具体的病理病机发展中,各位医家又有不同的见解,许多医家认为当以血瘀为主,也有医家认为当以痰浊或虚损为主,但少有关于湿证的研究。《症因脉治·胸痹》有云:“胸痹之因,饮食不节,饥饱损伤,痰凝血滞,中焦混浊,则闭食闷痛之症作矣”;又如明代《医学正传》有云:“津液黏稠,为痰为饮,积久渗入脉中,血为之浊”,可知胸痹心痛的病机是湿浊入脉,阻碍气血运行,血液久滞而浑浊,导致损伤心之脉络。

祛湿化痰方是陈可冀院士总结多年医治冠心病的临床经验所创,本方以“湿损血络”为病机核心,以不换金正气散及二陈汤为基础,主治胸痹心痛之湿症。方中以厚朴和苍术共为君药,厚朴温中下气、破血化滞,苍术除湿理气、总解诸郁,二药合用,着重在除中焦之湿浊,温煦行气,使脉中之湿尽去,并推动脉中血液运行,以奏宽中理气、除湿开郁之功。陈皮、法半夏为臣药,与二陈汤中的用法雷同,可燥湿化痰、理气散结,而与二陈汤相比,祛湿化痰方中法半夏之量比陈皮多,故燥湿之力比二陈汤更甚。莪术主治心膈痛,为治积聚诸气之要药,可行气活血通络,在祛湿化痰方佐助君药祛瘀行气。石菖蒲取其气味,引气入心经,舒心气之妙药,可行气祛湿开窍,引领诸药进入心经,直达病位。君臣佐使合参,共奏祛湿化痰、行气活血之功。

本研究通过网络药理学分析祛湿化痰方治疗冠心病的具体效应靶点。获得核心化合物成分包括汉黄芩素、柚皮苷、川皮苷、β-谷甾醇、黄芩苷元等,大多可以起到改善冠心病病人症状的作用。有研究显示,β-谷甾醇可降低心肌炎症反应,抑制心肌细胞凋亡,缓解心肌损伤[3]。川皮苷可以显著缓解内质网应激相关凋亡信号通路关键调节因子的表达水平[4]。有研究发现,汉黄芩素防治冠心病的作用机制包括抑制心肌缺血再灌注损伤、抗炎和抗氧化[5-6]。有研究表明,柚皮苷可减少细胞凋亡/焦亡,从而减轻心肌超微结构,抑制心室重构,改善心功能[7-8]。

核心基因与小分子化合物配对显示,药物及疾病的交集核心基因共有7个,其中ESR1、AKT1、MAPK1、MAPK3、MAPK14这5个基因与冠心病关联最为紧密。MAPK1、MAPK3、MAPK14均是丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路中的重要信号分子,通过干预MAPK信号通路参与了细胞肥大、增生、凋亡的过程[9]。多项研究显示,心肌ESR1在褐家鼠心血管组织中的表达较多,可以激活MAPK信号通路,影响PI3K-AKT信号通路的传导,增强其抗氧化能力,缩小梗死面积,减少心肌细胞凋亡,减轻炎症和氧化应激,诱导血管扩张和增加新生血管[10-12]。众所周知,心肌细胞凋亡和存活与AKT信号通路密切相关。有研究认为,AKT1作为AKT信号通路重要的信号分子,除了具有调控细胞凋亡的作用外,还可能通过促进炎症反应,干涉成纤维细胞的转分化,从而影响心肌纤维化[13-14]。

本研究通过分子对接运算后显示,柚皮苷与ESR1、AKT1,汉黄芩素与MAPK3、MAPK14均具有较小的结合能,且分子构象稳定,说明祛湿化痰方可能主要通过影响ESR1、AKT1、MAPK3、MAPK14等靶基因的表达来发挥治疗冠心病的作用。通过GO生物过程及KEGG通路富集分析,并结合冠心病疾病发展的特点,发现氧化应激机制、细胞凋亡机制、雌激素通路、PI3K-AKT信号通路等与冠心病关联最为密切,且富集较多,极有可能是祛湿化痰方治疗冠心病的潜在机制及通路。多项研究表明,在雌激素通路中,雌激素可以多途径来激活PI3K-MAPK信号通路,调节细胞凋亡机制、氧化应激反应机制、减轻病理性心肌肥大等[10,15-17]。研究显示,PI3K-AKT信号通路是一个强表达的生物信号系统,在心肌细胞凋亡中发挥重要的作用,并调控缺血再灌注损伤,影响氧化应激损伤,改善心肌细胞超微结构,与心肌细胞及心功能的恢复有关[18-20]。在PI3K-AKT信号通路及雌激素信号通路中,发现大量与本研究相关的基因蛋白靶点,尤其是核心基因蛋白靶点AKT1及ESR1占据信号通路中的重要部分,可见祛湿化痰方极有可能通过影响AKT1及ESR1信号通路的传导来调节心肌细胞凋亡、氧化应激损伤干预冠心病的进展。

综合分析本研究结果发现,祛湿化痰方中存在柚皮苷、汉黄芩素等小分子化合物,通过分子对接技术证明,其可以稳定结合ESR1、AKT1、MAPK1等基因受体,很有可能干预到雌激素信号通路及PI3K-AKT信号通路的传导,起到调节细胞凋亡、氧化应激反应的作用,从而改善冠心病及其临床症状。后续将继续完善相关临床试验,进一步验证祛湿化痰方治疗冠心病的分子机制及生物通路机制,为临床治疗冠心病心绞痛提供新的选择。