植物细胞自噬及在逆境胁迫中的作用

周如欣,史树德

(内蒙古农业大学 农学院,内蒙古 呼和浩特 010019)

1 植物细胞自噬

自噬是一种普遍存在于真核生物体内的进化上高度保守的胞内物质降解途径,主要用于胞内物质的更新和营养匮乏状态下的细胞存活,同时也参与个体衰老和病原体侵染等过程。自日本科学家因自噬方面的贡献获得诺贝尔奖之后,自噬的研究热度与日俱增,对植物的研究也逐渐从模式作物向农作物拓展,这些研究发现,自噬在作物抗逆生理中发挥重要作用。为更好地理解自噬在其中扮演的角色,本文对自噬的分子机制、在逆境胁迫中的作用与机制等进行总结。

1.1 自噬的分类

植物细胞自噬按内容物及运输方式分为巨自噬(macroautophagy)、微自噬(microautophagy)和超自噬(mega-autophagy)三种[1-2]。按对降解底物的选择性又可分为选择性自噬和非选择性自噬。巨自噬最显著的特征就是存在双层膜的自噬体(autophagosome),通过形成自噬体包裹待降解物,随后自噬体外膜与液泡膜融合,内膜释放入液泡形成自噬小体(autophagic body),最终底物在水解酶的作用下被降解[3-4]。微自噬指的是液泡膜通过内吞作用将待降解物直接包裹进液泡[5]。超自噬指通过液泡膜渗透或破裂,直接向细胞质释放大量液泡水解酶,实现在细胞质中降解细胞质物质的一种极端自噬过程,是植物特有的自噬[6];超自噬通常也降解细胞壁,最终导致细胞死亡,是发育性细胞程序性死亡(Programmed cell death,PCD)最后阶段的典型特征,参与植物发育和抗病[2]。巨自噬是最主要的自噬降解途径,也是通常意义上的自噬,无特殊说明时,本文所述自噬即为巨自噬。

1.2 自噬的分子机制

自噬的本质是细胞内的膜重排,通过膜的封闭与融合实现细胞内容物的更新。自噬过程主要包括:自噬的诱导、自噬前体的形成、自噬前体膜的延伸与闭合、自噬体转运和降解[7]。

1.2.1自噬的诱导

植物SnRK1(Sucrose non-fermenting-1-related protein kinase 1)在能量供应受限时,可以协调转录调控网络以维持细胞的能量稳态[8]。研究表明,拟南芥(Arabidopsisthaliana)SnRK1在TOR(Target of rapamycin)通路的上游激活自噬[9];生长正常时,TOR激酶复合体可磷酸化自噬相关蛋白Atg13(Autophagy related protein,Atg),高度磷酸化的Atg13与Atg1的结合能力下降,自噬被抑制;当植物遭受胁迫时,TOR激酶失活,去磷酸化的Atg13与Atg1结合能力增强,激活Atg1激酶并使其自磷酸化,随后Atg1-Atg13与Atg11、Atg101形成紧密的激酶复合体,从而启动自噬[10-12]。

1.2.2自噬前体的形成

自噬前体组装位点(Phagophore assembly site,PAS)是自噬体最开始组装的位置[13-15]。Atg1/Atg13蛋白激酶复合体首先被募集到PAS,随后结合PI3K复合体与Atg9复合体促进自噬前体形成。

植物PI3K复合体由VPS(Vacuolar protein sorting)复合物Ⅰ(VPS34、VPS30/Atg6、VPS15、Atg14);VPS复合物Ⅱ(VPS34、VPS30/Atg6、VPS15、VPS38)组成[16-17]。VPS复合物Ⅰ由Atg14直接与VPS30互作被招募到起始膜上,通过磷酸化自噬前体产生PI3P富集吞噬细胞膜,作为PI3P结合效应物招募的平台招募下游自噬相关蛋白参与自噬体的组装[18]。

Atg9复合体由Atg9、Atg2、Atg18组成。自噬发生时,跨膜蛋白Atg9在Atg1-Atg13激酶复合体协助下将脂质传递到PAS,与膜蛋白Atg2-Atg18复合物互作,辅助自噬前体膜的延伸[19-21]。

Atg13被认为是起始复合物的枢纽。首先,Atg13作为激酶活性调节剂以Atg1为核心组成Atg1-Atg13复合物,并通过与Atg17相互作用连接Atg17-Atg31-Atg29二聚体,最终形成以Atg1为核心的五聚体,称为Atg1激酶复合物。该复合物启动PAS的形成并作为支架蛋白将其他Atg蛋白陆续组装到该位置。PAS的稳定性亦依赖于Atg13、Atg17和其他蛋白的相互作用[22]。其次,Atg13通过与液泡蛋白Vac8相互作用将PAS稳定地锚定在液泡上,PAS的稳定定位是高效自噬的必要条件[23-25]。最后,Atg13又与Atg101通过HORMA(the Hop1p, Rev7p and MAD2 proteins)结构域形成稳定的空间构象[26-27]。Atg101的C末端区域和WF finger分别在促进自噬下游PI3K复合物和PI3P复合物的关键组分募集中起到关键作用[28]。

1.2.3自噬前体膜的延伸与闭合

自噬前体膜的延伸需要依靠Atg8-PE(Phosphatidylethanolamine,PE)和Atg12-Atg5。

Atg8-PE系统是自噬体膜的重要组成部分,直接作用于膜的延伸。Atg8在Atg4作用下与具有泛素活化酶E1活性的Atg7连接,最后在具有E2活性的Atg3催化下与PE结合形成Atg8-PE复合体[29-32]。这个过程称为Atg8的脂化,脂化的效率依赖于Atg16的存在[33]。

Atg12-Atg5系统包括Atg12、Atg7、Atg10、Atg5、Atg16。Atg12首先与E1酶Atg7结合,二者结合后由具有泛素交联酶E2活性的Atg10修饰转移并与靶蛋白Atg5结合,形成Atg12-Atg5复合体。最后Atg12-Atg5与Atg16结合,促进Atg5膜结合位点的暴露,进而促进复合物与膜结合。在自噬体形成早期,该复合物可以促进Atg8与PE的脂化并决定Atg8在膜上脂化的位点[34-36]。Atg8的定位依赖于Atg12-Atg5-Atg16,但Atg12-Atg5-Atg16却能在Atg8缺失的菌株中正常定位[37]。

Atg8-PE复合物不断组装在延伸中的自噬前体膜上,并通过Atg8家族相互作用基序招募一种植物特有的非Atg适配蛋白SH3P2(SH3 domain-containing protein 2)和其相互作用蛋白FREE1(FYVE domain protein required for endosomal sorting 1)来封闭囊泡[38-39]。自噬体与液泡融合后,附着在外膜上的Atg8被Atg4从PE上裂解并释放回胞浆,内膜上的Atg8-PE复合物则在液泡中被降解,Atg9从PAS返回胞质中的膜结构[32, 40]。

1.2.4自噬体转运和降解

成熟的自噬体通过微管被运送到液泡,外膜与液泡膜融合,内膜被释放入液泡中。在这个过程中,Atg11促进自噬体向液泡的转运[41]。CFS1作为自噬适配器存在于自噬体上,与Atg8作用介导自噬体的成熟与运输,且特异性的调节自噬流而不影响其他液泡通路或液泡形态[42]。融合过程中SNARE (soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor) 复合体参与并介导[43]。最后,内膜在脂酶Atg15的作用下被降解,待降解物被降解并释放到细胞质回收再利用,以维持细胞内环境稳态[44]。

2 细胞自噬参与植物逆境胁迫

自噬被认为是一种基础的防御和应激调控机制,对细胞的修复、重建和再生有促进作用[45]。正常情况下,自噬仅作为一项基本的蛋白质量调控机制而处于基础水平。但当植物受到特定信号刺激如营养饥饿、温度胁迫、渗透胁迫、病原体侵染时,自噬被大量诱导以抵抗胁迫。

2.1 自噬参与低氮胁迫

对大多数植物来说,氮素利用效率(Nitrogen use efficiency,NUE)主要取决于如何吸取无机氮,同化硝酸盐和铵盐,并循环有机氮。自噬在这些过程中的作用被自噬缺陷突变体所突出表现,而相应的自噬过表达植株则有更好的表现。

自噬通过参与植物无机氮的吸收与同化最终增强胁迫耐受性。苹果(Maluspumila)过表达MdATG10可增强自噬活性,提高氮转运蛋白基因表达量和氮代谢酶活性以应对低氮胁迫[46]。苹果过表达MdATG9增强了愈伤组织对氮饥饿的耐受性,且MdNRT1.1、MdNRT2.5、MdNIA1和MdNIA2的表达量和氨基酸与蔗糖的含量均高于野生株系,表明MdATG9在苹果应对营养饥饿时起着重要作用[47]。苹果MdATG8i和MdATG18a的过表达同样提高植株在应对氮饥饿时的耐受性[48-49]。对番茄(Solanumlycopersicum)自噬基因的研究表明,番茄叶片和根系的自噬受低氮胁迫诱导,过表达ATG6可提高氮代谢相关酶活性,促进氮吸收,提高氮同化效率和蛋白质积累量[50]。水稻(Oryzasativa)过表达OsATG8a在氮充足情况下,氮素吸收效率和氮素利用效率均显著提高,但在氮饥饿情况下仅氮素吸收效率具有显著提高;OsATG8b基因在低氮情况下被高度诱导,过表达OsATG8b可显著提高氮代谢相关酶活性、氮素吸收效率,氮素利用效率和氮素再动员效率;过表达OsATG8c在氮充足与氮饥饿情况下的氮素吸收效率和氮素利用效率均显著提高,认为自噬可提高水稻氮素利用率[51-53]。低氮胁迫下,茶(Camelliasinensis)CsATG3a在拟南芥中过表达延长了拟南芥营养生长期,促进了营养生长并影响氮的分配[54]。平邑甜茶(Malushupehensisvar.mengshanensis)中,通过适度抑制TOR活性来增强自噬活性,可以改善低氮胁迫下的生长状态,增强对胁迫的耐受性[55]。

植物生殖生长阶段,氮素吸收能力下降,甚至部分情况下会被完全抑制,例如欧洲油菜(Brassicanapus)由营养阶段向生殖阶段过渡,以高亲和力转运系统和双亲和力转运系统活性的急剧下降为特征[56]。由于氮吸收活性的下降,植物需要另一种氮源。自噬通过对营养物质的循环和再动员参与生殖阶段种子的形成并调控植物衰老。水稻ATG7-1突变体与野生型相比,生物量和NUE明显降低,叶片衰老过程中的氮素再动员也受到抑制,同时突变体老叶中残留的蛋白质以可溶性蛋白质为主,二磷酸核酮糖羧化酶(Rubisco)酶的浓度约为野生型的 2.5 倍,认为自噬通过促进衰老叶片中的蛋白质降解,从而在全株水平上促进氮的高效再循环[57]。玉米(Zeamays)ATG12突变体幼苗在氮饥饿情况下生长严重受损,植株成熟后叶片衰老加剧,穗部发育受阻,且氮素再动员降低[58]。大豆(Glycinemax)GmATG8c在拟南芥中过表达提高了细胞的氮饥饿耐受性,缩短营养生长期,更早进入生殖生长,有更高的种子产量[59]。拟南芥实验表明,所有自噬缺陷突变体的氮素再动员效率均降低且仅与营养期叶片衰老程度有关,认为自噬是植物高效氮素再动员和种子灌浆所必需的[60-61]。

以上针对不同植物的自噬相关基因的研究表明植物细胞自噬与氮素营养密切相关。

2.2 自噬参与高温胁迫

研究表明,高温胁迫下植物细胞自噬相关基因被诱导表达,自噬结构大量形成[62]。高温胁迫下,拟南芥ATG5和ATG7缺陷突变体的耐热性降低,膜系统和光合系统较野生型受损严重[63]。在番茄中过表达苹果MdATG5-1和MdATG5-2增强了膜系统稳定性,减少活性氧积聚,增强对高温胁迫的耐受性[64]。苹果过表达MdATG18a植株在高温胁迫下活性氧积累减少,气孔收缩程度较小,有更好的散热能力,认为自噬通过降解受损叶绿体减少异常叶绿体产生的活性氧对细胞的损伤增强了耐热性[65]。番茄植株中,ATG5和ATG7被高温诱导表达,将其分别沉默后,植株耐高温能力明显下降,生物膜稳定性下降,膜透性增加,光合系统受损严重,认为自噬通过保护膜结构和光合系统抵抗高温带来的损伤[62]。

另外,自噬会降解植株在应对高温胁迫时的另一重保护措施——热激蛋白(Heat shock protein,Hsp),导致植物在面对第二次高温胁迫时反应缓慢,相对于自噬突变体受损更重。拟南芥中选择性自噬受体NBR1与Hsp 90.1 和Rof1互作并通过自噬介导其降解,导致面对二次热胁迫野生型植株反应缓慢,自噬缺陷植株反应迅速[66]。拟南芥中ATG7突变能修复热敏感基因突变体的耐热性缺陷,认为植物细胞自噬是植物耐热的不利因素[67]。

综上所述,自噬在植物面对高温胁迫时具有两面性,一方面通过保护膜结构和光合系统等抵抗高温胁迫;另一方面通过降解热激蛋白使植物在面对二次高温胁迫时避免产生更大损伤。

2.3 自噬参与渗透胁迫

细胞自噬在植物抵御渗透胁迫如干旱胁迫和盐胁迫中发挥重要作用。苹果MdATG5-1和MdATG5-2基因在番茄中过表达时,在干旱条件下比野生型有更高的叶片相对含水量,活性氧积累量、相对电导率和丙二醛含量则显著低于野生型,认为自噬有助于维持干旱胁迫下的细胞稳态,增加干旱抗性[64]。同样的,苹果过表达MdATG10在干旱条件下较野生型有更多的生物量积累,更高的净光合速率和水分利用率,且长期干旱胁迫下活性氧积累较少,生物膜系统受损程度较低,显著增强了植株抗旱性; 另外,脱落酸的合成与信号相关基因表达量均下降,认为可能由此调节了气孔开度,帮助植株更好适应长期干旱[46]。苹果MdATG8i过表达植株在盐胁迫下Na+积累较少,叶片中脱落酸积累较少,气孔开度较野生型大,精氨酸和多胺含量均高于野生型,认为MdATG8i可能通过影响多胺的代谢增强耐盐性;MdATG10过表达植株光合系统受损较轻,根系导水率较高,并且离子转运相关基因MdSOS1、MdSOS2和MdSOS3的表达量均高于野生型,Na+积累较少,认为MdATG10通过影响离子转运,增强植株耐盐性[65]。黄瓜(Cucumissativus)CsATG8a和CsATG8f在拟南芥中过表达在盐胁迫下比野生型的根长和鲜重更高,相对电导率较低;在黄瓜中过表达时在干旱与盐胁迫下的抗氧化酶活性均显著高于野生型,认为植株在应对渗透胁迫时,通过自噬减少胁迫带来的伤害[68]。

综上所述,过表达自噬相关基因可增强植株对膜系统、光合系统以及水分的利用,减少胁迫损伤并提高耐受性。

2.4 自噬参与病原体侵染

植物在遭受病原体侵染时自噬被诱导以抵抗侵染。陆地棉(Gossypiumhirsutum)曲叶病毒的βC1蛋白通过与甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase,GAPDH)结合破坏GAPDH与Atg3的相互作用来激活自噬,而βC1与GAPDH结合被破坏将减少病毒诱导的自噬并增强病毒感染,认为植物在应对病毒侵染时通过自噬途径抵抗侵染[69]。本氏烟草(Nicotianabenthamiana)中植物蛋白NbP3IP与水稻条纹病毒编码的RNA沉默抑制蛋白p3互作,并通过自噬途径降解p3,影响p3的沉默抑制活性,ATG5或ATG7被沉默的植株中,水稻条纹病毒感染加剧,而GAPDH沉默的植株中,自噬被激活,病毒感染受到抑制,认为自噬参与抑制水稻条纹病毒的感染[70]。

在宿主植物与病原体互作的过程中,病原体可以反过来通过自噬途径侵染宿主植物。核盘菌可分泌植物毒素草酸触发宿主无限制细胞死亡以便侵染宿主,而草酸缺陷突变体具有非致病性,能够激活自噬,触发宿主限制性细胞死亡,抵御病原体侵染[71]。同样,大麦(Hordeumvulgare)条纹花叶病毒(barley stripe mosaic virus,BSMV)的γ-b蛋白通过与Atg7直接相互作用破坏Atg7-Atg8的相互作用抑制宿主植物自噬,破坏自噬介导的植物抗病毒防御,从而促进感染[72]。苹果中MdAtg8i通过与靶蛋白MdEF-Tu互作,降低苹果对腐烂病菌敏感性;腐烂病菌效应蛋白Vm1G-1794通过与MdAtg8i互作抑制细胞自噬活性,并竞争性结合MdAtg8i,使MdEF-Tu积累以削弱对腐烂病菌抗性,过表达MdATG8i时对腐烂病菌抗性有显著提高,认为苹果腐烂病菌通过分泌效应蛋白操纵苹果细胞自噬途径[73]。

综上所述,自噬在植物应对病原体侵染过程中发挥双重作用,一方面自噬抑制部分病原体感染;另一方面部分自噬相关蛋白可能作为病原体效应物的靶标,被病原体利用侵染宿主植物。

3 总结与展望

自噬作为一种进化上保守的胞内物质降解途径,广泛参与个体生长发育过程与胁迫应激反应。近年来对自噬的研究不断深入,但仍有很多问题需要研究。例如,自噬体膜的来源、植物细胞自噬响应逆境的机理、细胞自噬的活性在什么范围内能维持个体生长发育与应对胁迫之间的平衡、自噬如何协调植物激素共同抵抗逆境等。要解决这些问题需要进一步研究自噬基因的功能与核心组分的作用机制,随着科技的不断发展,自噬的分子机制将得到更深入的研究。