HPLC双波长切换法同时测定仙桃草中木犀草素、芹菜素、金圣草素的含量

周倩倩 沈振 王兆昆 张加余 汪冰 林永强

【摘 要】 目的：测定仙桃草中木犀草素、芹菜素、金圣草素等3种黄酮类成分的含量。方法：以甲醇提取制备分析样品，采用纳谱ChromeCore C18色谱柱（5 μm，4.6 mm×250 mm），以乙腈-0.1%磷酸溶液（23：77）为流动相，流速1 mL/min，检测波长为350 nm（木犀草素、金圣草素）和337 nm（芹菜素），柱温35 ℃。结果：木犀草素、芹菜素、金圣草素在各自范围内线性关系良好（r≥0.9996），平均加样回收率分别为97.79%、98.77%、97.28%，RSD分别为0.94%、0.91%、0.77%。13批样品的木犀草素含量在0.0391～0.7979 mg/g之间，平均值为0.5503 mg/g；芹菜素含量在0.0556～0.2655 mg/g，平均值为0.1938 mg/g；金圣草素含量在0.0575～0.2484 mg/g，平均值为0.1711 mg/g。结论：该方法准确、可靠、重现性好，可用于仙桃草质量控制。

【關键词】 仙桃草；HPLC双波长切换；木犀草素；芹菜素；金圣草素

【中图分类号】R284.1   【文献标志码】 A    【文章编号】1007-8517（2023）08-0045-05

Abstract：Objective To determine the Luteolin，Apigenin and Chrysoeriol from Veronica peregrina L.by HPLC.Methods Samples for analysis were prepared by methanol，the analysis was performed on a 35℃ themostatic Nano ChromeCore C18 column（250 mmx4.6 mm， 5 μm）， with the mobile phase comprising of acetonitrile-0.1% phosphoric acid （23∶77） flowing at 1.0 mL/min， and the detection wavelength were set at 350 nm for Luteolin and Chrysoeriol and 337 nm for Apigenin.Results Luteolin，Apigenin and Chrysoeriol show good linear relationships within their own ranges（r≥0.9996）， whose average recoveries were 97.79%， 98.77% and 97.28%， with the RSDs of 0.94%， 0.91% and 0.77%， respectively. The contents of the Luteolin， Apigenin and Chrysoeriol of the 13 samples were varied between 0.0391-0.7979 mg/g， 0.0556-0.2655 mg/g and 0.0575-0.2484 mg/g，with the averages of 0.5503 mg/g， 0.1938 mg/g and 0.1711 mg/g， respectively.Conclusion This accurate， reliable and reproducible method can be used for the quality control of Purslane Speedwell.

Key words：Purslane Speedwell; HPLC dual-wavelength method; Luteolin; Apigenin; Chrysoeriol

仙桃草为玄参科植物蚊母草Veronica peregrina L.带虫瘿的干燥全草。虫瘿内的小虫为象虫科昆虫仙桃草直喙象Gymnetron miyoshii Miyoshi。用于吐血、咯血、齟血、便血、跌打损伤，具有活血消肿、止血、止痛的作用［1］。金继曙等［2］从仙桃草中分离出原儿茶酸、香草酸、木犀草素、金圣草素、甘露醇等5种化学成分。课题组研究发现仙桃草中含有芹菜素，并通过对照品定位、紫外吸收扫描、液相色谱-质谱联用进行了确认。目前，仙桃草相关文献报道较少，质量控制相对薄弱，刘华本等［3］、宋光伟等［4］分别对仙桃草中原儿茶酸、木犀草素的含量进行了测定，但金圣草素、芹菜素的测定尚未见文献报道。木犀草素具有较好的促凝血作用［5］，芹菜素对肿瘤、衰老及心血管疾病有预防和控制作用［6］，金圣草素具有抗菌消炎的作用［7］。为有效控制仙桃草质量，研究建立木犀草素、芹菜素、金圣草素等3种黄酮类化合物的HPLC含量测定方法，为克服在同一波长下某些成分响应较低的缺点，提高各成分响应程度，使测定结果更加准确，需保证各成分在最大吸收波长处检测，由于三种待测成分的最大紫外吸收波长存在差异，因此本研究采用波长切换法同时测定3种成分的含量，方法简便、准确、灵敏，为完善和提高仙桃草质量标准提供参考依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器 岛津

LC-2030C 3D Plus

液相色谱仪，Mettler Toledo XSE205电子天平，纳谱ChromeCore C18色谱柱（5 μm，4.6 mm×250 mm）。

1.2 材料 木犀草素对照品（批号：111520-200504，含量100.0%，中国食品药品检定研究院），芹菜素对照品（批号：111901-202004，含量99.4%，中国食品药品检定研究院），金圣草素对照品（批号：0209-RD-0032，含量90.8%，广州佳途科技股份有限公司）。乙腈为色谱纯，甲醇、磷酸分别为分析纯，水为屈臣氏蒸馏水。仙桃草药材购自市场，编号为S1～S13，共计13批，其中6批购自亳州市云兴中药科技有限公司，7批购自河北弘森药业有限公司，经滨州医学院林莺副教授鉴定为玄参科植物蚊母草（Veronica peregrina L.）带虫瘿的干燥全草。

2 方法与结果

2.1 芹菜素的确认 从初期研究发现该色谱峰与芹菜素对照品保留时间及最大紫外吸收均一致，初步判定为芹菜素。由于芹菜素具有较强的酸性，易失去氢质子形成负离子被检测，灵敏度更高［6］。因此，为进一步验证该色谱峰为芹菜素，选用HPLC-MS法进行确认。采用三重四极杆质谱检测器，电喷雾离子化（ESI）负离子模式下多反应监测（MRM），监测离子对为m/z 268.99→117.05、m/z 268.99→107.05、m/z 268.99→151.05，以甲醇为流动相A，0.1%甲酸溶液为流动相B，梯度洗脱：0～10 min，A：60%→40%，B：40%→60%，流速为每分钟0.3 mL。结果如图1、图2所示。

从图中可以看出，芹菜素对照品和供试品色谱总离子流（TIC）完全一致，以质荷比（m/z）268.99→117.05、m/z 268.99→107.05和m/z 268.99→151.05离子对提取的供试品离子流色谱中，同时呈现与芹菜素对照品色谱保留时间一致的色谱峰。因此可以判定，该色谱峰为芹菜素。

2.2 检测波长的选择 分别取木犀草素、芹菜素、金圣草素对照品，分别加甲醇制成浓度为40 μg/mL的对照品溶液，以甲醇为空白，采用紫外-可见分光光度计在200～400 nm对3个成分进行光谱扫描，确定木犀草素的最大吸收波长为350 nm和254 nm，芹菜素的最大吸收波长为337 nm和267 nm，金圣草素的最大吸收波长为348 nm和268 nm。从紫外吸收谱图看，最大吸收波长±2 nm时吸光度差异不大，因此，确定木犀草素、金圣草素的测定波长为350 nm，芹菜素测定波长为337 nm。谱图如图3所示。

2.3 色谱条件 纳谱ChromeCore C18色谱柱（5 μm，4.6 mm×250 mm），以乙腈-0.1%磷酸溶液（23：77）为流动相，流速1 mL/min，检测波长木犀草素、金圣草素为350 nm，芹菜素为337 nm，柱温35 ℃，进样体积10 μL。

2.4 对照品溶液的制备 精密称取木犀草素对照品18.37 mg、芹菜素对照品18.91 mg、金圣草素对照品16.86 mg，分别置25 mL、50 mL、50 mL量瓶中，加甲醇适量使溶解，定容至刻度，摇匀；分别精密量取上述3种对照品溶液各1 mL，置同一10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

2.5 供试品溶液的制备 取本品适量，粉碎使其通过三号筛，取约2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，称定重量，加热回流2 h，取出，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，滤过，精密量取续滤液25 mL，蒸干，残渣加甲醇使溶解，定容至10 mL，滤过，取续滤液，即得。

2.6 系统适用性试验 取对照品溶液及供试品溶液，按“2.3色谱条件”项下的条件进样并记录色谱图。结果，待测组分色谱峰形较好，与其他组分分离度良好，理论板数以木犀草素计为23525，分离度分别为22.760、6.331、1.712。色谱图如图4、图5所示。

2.7 线性关系考察 分别精密吸取混合对照品溶液1 μL、2 μL、5 μL、10 μL、15 μL、20 μL，注入液相色谱仪，测定峰面积积分值，分别以木犀草素、芹菜素、金圣草素对照品进样量为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，进行线性回归，得回归方程。木犀草素线性回归方程为Y=4100066X+16538，相关系数r=1.0000；芹菜素线性回归方程为Y=4046730X+23355，相关系数r=0.9996；金圣草素线性回归方程为Y=3298116X+15860，相关系数r=0.9998。结果表明，木犀草素、芹菜素、金圣草素进样量分别在0.147～2.940 μg、0.0376～0.752 μg、0.0429～0.858 μg范围内与峰面积积分值呈良好线性关系。

2.8 仪器精密度考察 取混合对照品溶液，进样5 μL，连续进样6次，记录峰面积积分值，结果木犀草素、芹菜素、金圣草素峰面积积分值相对平均偏差（RSD）分别为0.56%、0.75%、0.66%，结果表明仪器精密度良好。

2.9 重复性试验 取本品适量，粉碎使其通过三号筛，取约2 g，照“2.5供试品溶液的制备”项下方法，平行制备供试品溶液6份，注入液相色谱仪，计算供试品中木犀草素、芹菜素、金圣草素的含量。结果木犀草素含量平均值为0.6348 mg/g，RSD为0.37%；芹菜素含量平均值为0.2336 mg/g，RSD为0.74%；金圣草素含量平均值为0.2000 mg/g，RSD为0.63%。结果表明，该方法重现性良好。

2.10 稳定性试验 取本品适量，粉碎使其通过三号筛，取约2 g，照“2.5供试品溶液的制备”项下方法制备供试品溶液，分别在0 h、4 h、8 h、16 h、24 h、48 h进样，测定峰面积积分值，计算RSD值，结果木犀草素为1.09%、芹菜素为0.78%、金圣草素为0.82%。结果表明，供试品溶液在48 h内稳定性良好。

2.11 加樣回收率试验 取已知含量的仙桃草样品，精密称取6份，每份取约1 g，分别加入木犀草素、芹菜素、金圣草素对照品溶液适量，再加入甲醇使其总体积为50 mL，称定重量，自“加热回流2 h”起，照“2.5供试品溶液的制备”方法同法制成回收率试验用供试品溶液，进样测定，计算回收率，仙桃草种木犀草素、芹菜素、金圣草素的平均回收率分别为97.79%、98.77%、97.28%，RSD值分别为0.94%、0.91%、0.77%，回收率良好。结果见表1。

2.12 样品含量测定 采用已建立的方法对收集的13批仙桃草样品进行测定，分别计算其中木犀草素、芹菜素和金圣草素的含量，结果见表2。结果13批仙桃草样品的木犀草素含量在0.0391～0.7979 mg/g之间，平均值为0.5503 mg/g；芹菜素含量在0.0556～0.2655 mg/g，平均值为0.1938 mg/g；金圣草素含量在0.0575～0.2484 mg/g，平均值为0.1711 mg/g。13批样品中有1批样品的3个待测成分含量均远低于其他批次，提示药材市场上流通的不同批次仙桃草的化学成分含量存在较大差异，可能与不同产地的气候、环境、土壤等因素有关。

3 讨论

3.1 流动相的选择 本研究比较了甲醇、乙腈与水、0.1%磷酸溶液、0.1%冰醋酸溶液不同比例的流动相系统，结果以乙腈-0.1%磷酸溶液系统分离效果最佳，通过系统耐用性试验考察最终确定流动相比例为乙腈-0.1%磷酸溶液（23∶77）。

3.2 色谱柱及仪器耐用性考察 本研究分别比较了Sepax HP-C18色谱柱（5 μm，4.6 mm×250 mm）、纳谱ChromeCore C18色谱柱（5 μm，4.6 mm×250 mm）和依利特 Hypersil BDS C18色谱柱（5 μm，4.6 mm×250 mm）对仙桃草药材种3中待测成分的分离效果，结果3种色谱柱均能对待测成分进行有效分离。同时考察了岛津LC-2030C 3D Plus和沃特世2695两种液相色谱仪的分离情况，结果均能呈现良好的分离效果。

3.3 提取溶剂和方法的选择 本研究考察了甲醇、70%甲醇、50%甲醇、乙醇、70%乙醇、50%乙醇6种提取溶剂，超声、回流2种提取方式，0.5 h、1 h、1.5 h、2 h等4种提取时间，料液比 1∶10、1∶20、1∶25、1∶50 4种料液比，结果显示以甲醇作为溶剂，回流提取1 h效果最佳，为保证样品的取样均匀性又能节约资源，确定样品取样量为2.0 g，提取溶剂为50 mL。

综上，黄酮类化合物是中药材中重要的生物活性物质，仙桃草所含黄酮类化合物可作为评价其质量的指标成分。本研究采用HPLC双波长切换法同时测定仙桃草中木犀草素、芹菜素和金圣草素3种黄酮类成分的含量，确认了仙桃草中芹菜素的存在，可为仙桃草质量控制提供参考依据。

参考文献

［1］国家药典委员会. 中华人民共和国药典（一部）［M］.北京：人民卫生出版社，1977：164-165.

［2］金继曙，于在东，种明才. 仙桃草化学成分的分离［J］.中草药，1982，13（4）：10.

［3］刘华本，李晓维，潘旖，等. HPLC法测定仙桃草中原儿茶酸的含量［J］. 中国医药指南，2015，13（22）：54.

［4］宋光伟，刑茂，王伟，等. HPLC 法测定仙桃草中木犀草素的含量［J］. 中国药房，2009，20（15）：1166.

［5］都述虎，金繼曙. 仙桃草主要化学成分体外促凝血作用［J］.中草药，1996， 27（7）：416.

［6］丁健桦，王兴祥，张慧，等. 芹菜素的点喷雾萃取电离串联质谱［J］. 高等学校化学学报，2011，32（8）：1714.

［7］何新. 金圣草黄素在制备治疗阴道炎的药物的应用：CN111840273A［P］.2020-10-30.

（收稿日期：2022-08-23 编辑：刘 斌）