宏基因二代测序技术在肺部感染病原学检测中应用的研究进展

李 俏, 苏振中, 许璐璐, 张 捷

（1.吉林大学第二医院呼吸与危重症医学科，吉林 长春 130041;2.苏州大学附属第一医院呼吸与危重症医学科，江苏 苏州 215000）

肺部感染是呼吸系统常见疾病之一，病原学检查结果的准确与否直接决定肺部感染性疾病的临床治疗效果。传统病原微生物检测技术在临床上应用较广泛，例如血清学检测、病原体培养和聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR） 等，但是仍有较多缺陷，如检测所用时间长、易受广谱抗菌药物影响和与引物不匹配的微生物检测受限等。传统病原微生物检测技术的诸多缺陷使其应用受到限制，特别是对不常见的病原体和培养条件苛刻的致病菌，给肺部感染性疾病的精准诊断及治疗带来挑战。

近年来第二代测序技术不断发展，宏基因二代测 序 （metagenomic next-generation sequencing，mNGS）技术已应用于感染性疾病病原学检测，如呼吸道感染、血液感染、关节腔感染、中枢神经系统感染和胃肠道感染等，能够快速检出致病病原体，指导靶向抗菌治疗［1-4］。mNGS 技术有助于检测传统检测方法难以检出的致病菌，亦有助于提高新型病原体的检测水平。mNGS 技术通过对从支气管 肺 泡 灌 洗 液 （bronchoalveolar lavage fluid，BALF） 中提取的RNA 进行测序，从而迅速鉴定了新型冠状病毒［5］，mNGS 技术现已较普遍应用于感染性疾病病原的检测，如钩端螺旋体［6］和鹦鹉热衣原体［7］等。

mNGS 技术通过对病原体进行无假设、无偏倚和可定量的检测［8］，实现了高效及准确的病原体检测，在肺部感染性疾病中的应用价值也逐渐显现，为肺部感染性疾病的精准诊断提供了新思路。目前mNGS 技术在国内外也广泛应用于肺部感染性疾病病原体物种的鉴定和耐药基因研究等。本文作者分析mNGS 技术在不同类型微生物所致肺部感染性疾病中的应用及其在肺部感染性疾病不同类型样本中的应用，进一步探讨mNGS 技术的优势和面临的挑战，为其在肺部感染性疾病的精准诊断和治疗中的应用提供依据。

1 mNGS 技术的发展和原理

1977 年，SANGER 等［9］采用链终止抑制剂进行DNA 测序（即为Sanger 测序法），开创了分子检测的新方法，随着对测序通量需求的增加，检测技术和流程也得到了改进。2004 年，研究者［10］采用Sanger 技术完成了人类基因组检测，基于对人类基因组计划研究的需求，检测技术不断成熟，推动了二代测序技术的产生［8，11］。mNGS 技术是一种大规模多程序并行的测序过程，可利用基因组学研究样本中微生物的组成对病原体进行无假设、无偏倚和可定量的检测［1，8，12］。mNGS 技术原理包括合成法测序和连接法测序［8］，mNGS 技术分析检测过程包括临床样品处理、文库制备、测序和结果分析，最终结合临床得出诊断。现使用的测序平台有Illumina（中国）科学器材有限公司提供的一系列测 序 平 台 （iSeq、 MiniSeq、 MiSeq、 HiSeq、NextSeq 和NovaSeq 平 台）、美 国Thermo Fisher Scientific 公司提供的Ion Torrent 平台、英国BGI 公司提供的BGISEQ 平台、美国Oxford Nanopore Technologies 公司提供的便携式测序仪（MinION、GridION 和 PromethION） 等［1］。 并 采 用 基 于“spike-in”的校准来确定总微生物负荷［13］、采用捕获探针进行消减杂交、 基于核糖核酸酶（ribonuclease，RNase） 的去除方法以及靶向序列的CRISPR-含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶9（cysteinyl aspartate specific proteinase-9，Caspase 9）切割［1］等方法，尽量减少样本中其他核酸（人类宿主核酸和定植菌核酸等）的影响，从而达到准确鉴别病原体的目的。

2 mNGS 技术在肺部感染性疾病中的应用

2.1 mNGS 在肺部感染性疾病不同类型病原微生物鉴定中的应用

2.1.1 细菌检测 细菌是肺部感染性疾病最常见的病原体，目前临床仍以培养法作为细菌鉴定的“金标准”，但是检测的种类受限并且培养需时长。mNGS 对细菌检测的总体检测效能整体优于传统检测，且检测用时短。相关研究［14-16］显示：mNGS技术的检测阳性率高于常规检测，并对罕见菌有较高的诊断效能，如单核细胞增多性李斯特菌和痤疮丙 酸 杆 菌 等［17-18］。研 究［19-21］显 示：mNGS 技 术 和传统病原检测技术对常见病原细菌的检测敏感度比较差异无统计学意义，但mNGS 技术对罕见菌和体外培养条件要求苛刻细菌的检测效能明显优于传统病原检测技术，可作为传统病原检测法的有效补充。

2.1.2 真菌检测 在肺部感染性疾病的常见病原体中，真菌感染较细菌感染少。MIAO 等［19］研究显示：mNGS 技术在检测真菌方面较传统检测方法更具有优势，GU 等［16］采用Illumina 测序对多种体液（胸腔积液、腹腔积液和尿液等） 行mNGS 技术检测，结果显示：与传统病原学检测比较，mNGS 技术对真菌检测具有较高的灵敏度和特异度。LI 等［21］对肺组织标本进行mNGS 技术检测结果显示：mNGS 技术的应用提高了肺部侵袭性真菌感染的诊断效率，但也有研究［14，22］显示：虽然mNGS 技术对于病原检测的总体阳性率高于传统检测方法，但其在真菌检测方面无明显优势，特别是对于曲霉菌，这可能是由于真菌细胞壁的存在增加了检验的难度［22］。随着技术的进步和基因库的完善，mNGS 技术的检测效能优势将会逐渐突显。

2.1.3 结核/非结核分枝杆菌检测 结核病是我国常见的传染病之一，结核病的早期诊断有助于降低结核病的传播风险和患者的死亡率［23］，mNGS 技术可作为结核病传统病原检测技术的有效补充，有助于提高结核病的早期诊断率。研究［19，21，24］显示：mNGS技术对结核分枝杆菌复合体检测效能较高。ZHOU 等［23］研 究 显 示：在 结 核 菌 诊 断 方 面，mNGS 技术总体检测效能不亚于基因Xpert 利福平耐 药 量 核 酸 扩 增 （Xpert mycobacterium tuberculosis/rifampicin，Xpert MTB/RIF） 检 测 技术，并且可以同时对并发感染的其他致病菌及耐药基因进行检测。SHI 等［25］研究显示：mNGS 技术对肺结核的诊断灵敏度远高于痰抗酸染色法，但与Xpert MTB/RIF 检测和体外培养法比较差异无统计 学 意 义。ZHOU 等［23］研 究 显 示：mNGS 检 测 与Xpert MTB/RIF 检测对活动性肺结核的诊断灵敏度比较差异无统计学意义（44%vs42%，P>0.05），但高于传统方法（29%），上述研究结果的差异考虑与存在产生细胞外核酸较少的胞内菌有关，尽管mNGS 技术可以识别结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌，协助非结核分枝杆菌种类的鉴定［25］，但是由于结核分枝杆菌复合群内部同源性高，基因相似性很高，在覆盖不足的情况下难以确定结核分枝杆菌复合群中的物种，因此在应用于结核分枝杆菌复合群特定种类的鉴定时可能会造成一定误差［21］，如有必要，应进行靶向 PCR 法检测以进一步识别特定的结核菌株［23］，mNGS 技术与Xpert MTB/RIF 检测联合应用可提高结核病的诊断效能［24］。mNGS技术在结核病的诊断中具有潜在优势，随着技术的进步和相关数据库的建立，对特定结核菌株和耐药基因的鉴定效能也将不断提升。

2.1.4 病毒检测 目前临床使用的病毒检测方法中，免疫学检测和PCR 法检测应用较多，但检测需对病原体进行预判，限制了未知病毒的检测。近年来，mNGS 技术在各系统中病毒检测方面应用较多，MIAO 等［19］研究显示：mNGS 技术在病毒检测方面具有优势。VANRIJN 等［26］对慢性阻塞性肺疾病急性加重期呼吸道病毒的研究显示：mNGS技术诊断的灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值较高，鼻病毒在病毒病原体中的发病率最高，其次是流感病毒、冠状病毒及副流感病毒。GUAN等［27］对疑似病毒性脑膜炎患者行mNGS 检测，成功分离出疱疹病毒，并采用PCR 法加以验证，证实了其准确性。SOMASEKAR 等［28］对204 例急性肝衰竭患者的血清样本行mNGS 检测，共检测出8 例先前未被识别的病毒病原体感染。mNGS 技术还可以对未知病毒进行检测［7］，同时检测对抗病毒药物的耐药基因［29］，其已经为新型冠状病毒的鉴定、突变菌株的监测和流行病学研究提供了思路［5］，并为新型冠状病毒的疫苗设计、药物发现和诊断开发提供了分子基础［30］。

2.1.5 其他病原体 GU 等［7］发现：采用mNGS技术对未能明确病原体的肺部感染患者进行检测时诊断出5 例鹦鹉热衣原体肺炎患者。侯婕等［31］在诊断1 例发热和呼吸困难的患者时，发现患者传统培养和外斐试验结果均呈阴性，最终采用mNGS技术检测明确诊断患者患有恙虫病立克次体肺炎。因此在传统病原检测诊断困难时，可以利用mNGS技术检测快速和灵敏的特点，检测潜在的致病病原体，其具有较大的临床应用价值。

2.2 mNGS 技术在肺部感染性疾病不同临床标本中的应用

2.2.1 痰液和支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）标本 痰液是临床工作中常用的病原学检测标本，但易受污染及上呼吸道致病菌干扰，且很难获得深部下呼吸道标本，只有合格的痰标本才能用于痰培养，因此不是最佳标本［32］。痰标本联合侵入性技术在全球下呼吸道感染监测项目中被接受［33］，BALF 受口腔菌群影响小，但难以采集最深部标本，BALF 可在内窥镜下获得，因此具有侵入性［34］，建议患者治疗后，在影像学吸收欠佳且病情允许时，通过纤维支气管镜留 取BALF 标 本［35］，BALF 可 作 为 肺 部 感 染 患 者病原检测的有效补充。

研究［36-37］显示：采用BALF 进行病原学检测可以提高诊断效能，指导临床治疗。XIE 等［14］研究显示：采用mNGS 技术行痰液和BALF 病原学检测的灵敏度均高于传统培养。PENG 等［32］研究显示：合格的痰标本和BALF 标本的培养结果及抗菌药物灵敏度结果存在较大差异。BALF 可通过纤维支气管镜获得，可以代表下呼吸道感染的状态，BALF 在间质性肺炎、肺部感染和肺癌等多种肺部疾 病 的 诊 断 检 查 中 发 挥 重 要 作 用［38］。CHEN 等［36］采用mNGS 技术对BALF 进行病原检测，检测阳性率为85%，优于传统检测。特别是在免疫功能缺陷患者的诊断中，mNGS 技术对于BALF 样本的检测具有潜在优势，同时提高了重症社区获得性肺炎微生物的检出率［37］。mNGS 技术对肺部真菌感染、寄生虫感染、病毒感染和痰涂片/培养阴性的肺结核BALF 样本具有较高的诊断价值，但其对于结核病的诊断尚存一定争议，有研究［25］显示：mNGS 技术和体外培养技术的检测效能比较差异无统计学意义。BALF 不仅可以应用于肺部感染的诊断，而且可以帮助鉴别潜在恶性肿瘤导致的肺部病变和肺泡出血等［38］。

2.2.2 肺组织标本 肺组织的微生物培养和病理学检查可以作为侵袭性真菌感染的辅助诊断，研究［21，39-40］显示：mNGS 技术检测患者肺部病原体时可以通过肺活检组织进行，这种方法在检测速度和灵敏度方面具有潜在优势。LI 等［21］对肺活检组织行mNGS 技术和传统培养方法进行分析，结果显示：mNGS 技术对细菌和真菌检测的灵敏度分别为100.0% 和57.1%，特异度分别为76.5% 和61.5%。与组织病理学方法比较，mNGS 技术在真菌（特别是侵袭性真菌）和结核分枝杆菌复合群的评估中，特异度（100.0%和 94.1%）和阳性预测值（100.0%和75.0%）较高［21］。有学者［41］认为：目前关于肺部感染中对肺活检组织标本采用mNGS技术的研究较少，与无细胞体液比较，组织标本中人类宿主核酸比例增加，使微生物核酸比例减少，可能导致mNGS 技术灵敏度降低，mNGS 技术可用于组织样本的病原学检查，但受宿主因素（背景核酸）的影响，现阶段已有多项技术致力于减少宿主因素的干扰。

2.2.3 血液标本 血液系统属于无菌微环境，血液系统感染可导致败血症甚至感染性休克的发生，这是住院患者死亡的重要原因之一。败血症不仅是重症肺炎患者常见并发症，同时也是导致重症肺炎患者预后不良的重要危险因素，因此对于血液系统感染的检测和早期诊治十分重要［36］。研究［35］显示：社区获得性肺炎（community-acquired pneumonia，CAP）患者并发菌血症的概率为5%～25%，因此建议所有需住院治疗的CAP 患者行血培养检测。但传统血培养易受抗生素使用的影响，并且检测周期长，容易延误病情，第二代测序技术检测周期短，可以快速检测血浆致病菌DNA 片段，并可对其耐药性进行分析［42］。由于致病菌会随着时间推移发生变化［43］，常规培养耗时长，可能会延误病情，建议可在早期采用mNGS 技术对重症CAP 患者行病原体检测。

研究［4］显示：健康人的血液中可检测到细菌DNA，其分类组成与脓毒血症不同，在脓毒症患者中，需氧或微需氧微生物 （75.1%） 占主导地位，而健康志愿者的血液中以厌氧双歧杆菌目的细菌DNA 为主（73.0%）。因此，虽然mNGS 技术可以快速且准确地检测出病原体，并且已有较多的辅助技术区分定植菌，但在采用mNGS 技术对血液行病原学检测时，仍需密切结合临床资料对检测结果进行综合分析以确定致病菌。

2.2.4 其他临床标本 mNGS 技术在其他标本中也有应用，目前已被应用于胸腔积液、脑脊液、脓液、间质液、骨髓、鼻拭子、关节液、超声处理液和尿液等标本的病原学检测［39，44-45］，但相关研究尚较少。WANG 等［44］研究显示：mNGS 技术提高了皮肤和软组织感染病原检测的敏感性，但在组织、脓液、拭子和间质液各样本中检测阳性率比较差异无统计学意义。HUANG 等［45］采用mNGS 技术对关节液、超声处理液和组织标本对骨关节感染进行诊断时发现：mNGS技术总体阳性率高于传统检测，并且在关节液和超声处理液中mNGS 技术总体阳性率亦高于传统培养。

3 mNGS 技术在耐药性分析中的应用

我国是抗生素消耗量最大的国家之一，抗生素的过度使用会导致耐药菌和耐药基因的产生，给临床治疗带来一定难度，成为公共卫生领域的挑战之一［43］。了解抗生素耐药基因谱与抗菌药物结果之间的相关性，建立公共抗生素耐药基因数据库将有助于个体化抗感染方案的实施。近年来，研究［42］证明：基于mNGS 技术诊断可以快速检测不同致病菌抗生素耐药基因及毒力因子，发现了许多种类的抗生素耐药基因，较传统药敏检测节约了大量时间，特别是传代周期长的微生物，如结核分枝杆菌。但由于缺乏传统耐药检测的验证，mNGS 技术在耐药性检测方面仍存在挑战，在准确性（需要稳健的质量控制）和耐药表型-基因型相关性方面仍然存在局限性，无法准确判定病原体对抗生素的耐药性［37］。技术层面，mNGS 技术可以快速检测耐药基因型，从而预测抗生素耐药表型，但其在耐药表型-基因型相关性检测方面仍然存在局限性［33］。因此，耐药表型和基因型方法互补，需协同检测以提高检测的灵敏度和特异度。

4 mNGS 技术在临床应用中的不足之处

虽然mNGS 技术有较高诊断效能，但仍存在一定的不足：①尽管已采用多种方法去除人类背景DNA/RNA，人类宿主核酸背景仍然会影响样本中的微生物核酸；②在取样、送检和检测过程中，均存在微生物污染可能，需要严格遵守操作流程的质量控制程序，以保持无菌和无核酸的测试环境［1，23］；③样本中微生物的浓度低于正常检测线或病原微生物未在检测范围会出现假阴性结果；④受病原体基因库的影响，对新物种的检测有一定限制；⑤对胞内菌、RNA 病毒和有细胞壁的病原体检测相对受限；⑥缺乏统一的报告解读标准［13］，需结合临床资料进行解读；⑦能对耐药基因进行检测，但无法准确判定病原体对抗生素的耐药性［37］。

5 结语和展望

肺部感染性疾病仍是临床工作的一大重点，mNGS 技术因其检测效率高、检测周期短、受抗生素应用的影响小及检测致病菌广泛等优点，已从实验室检测逐步应用于临床检测，指导临床用药，但仍存在一定局限性，建议将mNGS 技术作为传统病原学检测技术的补充，并深入探讨其临床应用价值，实现感染性疾病的精准诊断和治疗。