PEITC对NSCLC A549、H1299细胞凋亡的影响

王松柏, 曾钧发, 王柏琦

南华大学衡阳医学院附属第二医院肿瘤中心,湖南衡阳 421001

肺癌根据其分化程度、形态特征和生物学特点分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)。临床上约80%的肺癌病例为NSCLC患者,目前仍无改善NSCLC患者生存率的有效措施[1]。异硫氰酸苯乙酯(phenethyl isothiocyanate,PEITC)是一种人工合成单体,具有较好的抗肿瘤作用[2]。研究显示,PEITC可抑制多种肿瘤细胞的增殖并诱导其凋亡,且无细胞毒性[3]。本课题前期研究发现,PEITC能够抑制肺癌细胞侵袭[4],而其调控方式尚未完全阐明。

TMPRSS4是一种重要的Ⅱ型跨膜丝氨酸蛋白酶,在非小细胞肺癌中高表达[5]。TFPI-2是一种丝氨酸蛋白酶特异性抑制因子,也是一种潜在的抑癌基因,能够影响TMPRSS4表达[6]。本研究探讨PEITC对NSCLC A549、H1299细胞凋亡影响的分子机制。

1 材料和方法

1.1 主要实验材料

PEITC(LKT Laboratories公司),TRIzol试剂、cDNA合成试剂盒(Invitrogen公司);pcDNA3.0-TMPRSS4过表达质粒、siRNA-TFPI-2、pcDNA3.0-TMPRSS4(上海生物工程有限公司),pGL4.10-TMPRSS4真核表达质粒(汉恒生物科技有限公司),TFPI-2抗体、β-actin抗体(Cell Signaling),细胞凋亡检测试剂盒(江苏碧云天生物技术有限公司),DNA甲基化活性检测试剂盒(上海锐赛生物技术有限公司)。

1.2 细胞培养

人非小细胞肺癌A549、H1299细胞系购于ATCC公司。培养于10%胎牛血清的RPMI 1640培养液中,37 ℃、5% CO2条件下培养24 h,待细胞生长到80%时采用0、30、50 μmol/L PEITC进行后续处理,孵育结束后用于下一步研究。

1.3 MTT检测细胞增殖

生长于96孔板中的A549或H1299细胞经PEITC处理后继续培养24 h。随后每孔中加入10 μL MTT试剂后再孵育4 h,随后每孔加入150 μL二甲基亚砜,充分振荡后在酶标仪上设定波长为490 nm处测定各孔的光密度(optical density,OD)。

1.4 实时荧光定量PCR

取上述处理后的细胞,采用TRIzol试剂提取细胞总RNA,并用反转录试剂将其反转录为cDNA,随后加入引物对基因进行扩增。其中20 μL反应体系包括cDNA模板2 μL,2×反应Mix 10 μL,上下游引物各0.6 μL,最后用无RNA酶的去离子水补充至总体系20 μL。PCR条件:95 ℃预变性10 min,95 ℃变性10 s,58 ℃退火20 s,72 ℃延伸20 s,40个循环。TFPI-2上游引物为5′-AGACCGGTGAGCTGGATAG-3′,下游引物为5′-GTGATGTTGTGGTGGTGCC-3′;TMPRSS4上游引物5′-GACGAGGAGCACTGTGTCAA-3′,下游引物为5′-CTTCCCACAGGCAAGACAGT-3′;GAPDH上游引物为5′-AACCCATCACCATCTTCCAG-3′,下游引物为5′-CCAGTAGACTCCACGACATAC-3′。结果以2-ΔΔCt法计算各基因的相对表达水平。

1.5 Western blotting检测蛋白表达水平

细胞经PEITC处理结束后,加入RIPA裂解液提取细胞总蛋白,随后在样本中加入蛋白上样缓冲液后煮沸,测定蛋白含量后行SDS-PAGE。电泳结束后将其转到硝酸纤维素膜上,并用5%脱脂奶粉室温封闭2 h。充分洗膜后加入一抗,4 ℃孵育12 h,再加HRP标记的二抗,37 ℃孵育2 h,最后ECL发光、显影。

1.6 流式细胞术检测

收集经过上述处理后的A549、H1299细胞。PBS缓冲液清洗细胞2～3次,1 500 r/min离心5 min。加入预冷75%乙醇,于4 ℃固定4 h,1 500 r/min离心5 min弃上清,再加入400 μL溴化乙锭(50 mg/L),100 μL RNase A(100 mg/L)4 ℃避光孵育30 min后检测细胞周期。加入100 μL结合缓冲液重悬细胞,随后依次加入Annexin V-FITC和溴化乙淀溶液,37 ℃避光孵育后加入碘化丙啶进行染色用于流式细胞术分析。

1.7 甲基化特异性PCR

提取上述细胞DNA,纯化后按照试剂盒说明提供的方法建立反应体系,其中10 μL反应体系中包括5 μL PCR Mix、2 μL特异性引物、2 μL模板DNA和1 μL无酶水。置于PCR仪上,扩增反应条件:95 ℃预变性10 min,95 ℃ 30 s,56 ℃ 22 s,58 ℃ 32 s,35个循环。其中甲基化TFPI上游引物为5′-TTTCGTATAAAGCGGGTATTC-3′,下游引物为5′-ACGACCCGCTAAACAAAACG-3′;非甲基化TFPI-2上游引物为5′-GGATGTTTGTTTTGTATAAAGTG-3′,下游引物为5′-AAACATCCAAAAAAACACCTAAC-3′。扩增结束后分别将甲基化抑制剂5-aza-dc(阳性对照)、阴性对照含等体积的RPMI 1640培养液(ctrl)、10、30、50 μmol/L PEITC PCR产物用于琼脂糖凝胶电泳,凝胶成像系统成像。

1.8 甲基化活性分析

收集上述经PEITC处理前后的总蛋白,测定其含量后,根据试剂盒提供的步骤,将15 μg蛋白样品加入到含有胞嘧啶DNA孔中,随后加入捕获抗体,显色后10 min内在酶标仪上设置波长为450 nm,获取各孔OD值,TFPI-2相对活性=(处理组活性OD/对照组活性OD)×100%。

1.9 荧光素酶报告实验

采用转染试剂将构建好的pGL4.10-TMPRSS4荧光质粒分别转染至A549和H1299细胞中,并以pGL4.10荧光质粒作为对照,继续培养48 h。随后在上述细胞中加入裂解液,室温孵育15 min。孵育完成后10 000 r/min离心10 min,取上清进行TMPRSS4荧光素酶活性测定。

1.10 siRNA-TFPI-2与pcDNA3.0-TMPRSS4转染

siRNA沉默TFPI-2分为空白组(加入等体积培养基)、siRNA组(RNA对照)和转染组(TFPI-2 siRNA)。将长势良好的A549和H1299加入至6孔板中培养,随后将siRNA-TFPI-2加入至6孔板中,孵育20 h后弃去上清,并加入新完全培养基继续培养72 h进行传代。50 μmol/L PEITC处理细胞48 h,Western blotting检测细胞内TFPI-2的表达水平,以评估RNA干扰效果,所用干扰序列分别为5′-CAGCATGAGGAAACAAATCAT-3′和5′-TTGCAATGCATAAGATATAAA-3′。TMPRSS4转染时分为空白组(加入等体积培养基)、空载体组(加入等质量pcDNA3.0质粒)和转染组(pcDNA3.0-TMPRSS4)。在转染前,将A549或H1299细胞接种在6孔板中培养24 h。当细胞融合度达到70%～90%时,将培养基换成无抗生素和无血清培养基,2 h后根据Lipofetamine 2000(Invitrogen)转染试剂盒的说明进行转染。50 μmol/L PEITC处理细胞48 h,观察转染效果并收集细胞进行分析。

1.11 统计学分析

采用SPSS 18.0软件分析数据。数据比较采用Student-t检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 PEITC抑制NSCLC细胞增殖

不同浓度PEITC处理A549、H1299细胞48 h后,细胞增殖水平均显著降低(P<0.05),其中PEITC对A549细胞和H1299的IC50值分别为48.7 μmol/L和51.6 μmol/L(图1)。

图1 不同浓度PEITC对A549、H1299细胞增殖水平的影响a为P<0.05,与0 μmol/L比较;b为P<0.05,与10 μmol/L比较;c为P<0.05,与30 μmol/L比较。

2.2 PEITC诱导NSCLC细胞周期阻滞及凋亡

流式细胞术结果显示,不同浓度PEITC均能显著诱导A549、H1299细胞周期改变,表现为G1期细胞比例降低,G2和S期细胞比例增高(图2A);随着PEITC浓度的递增,A549细胞和H1299细胞凋亡率逐渐增高(图2B)。

图2 PEITC诱导A549和H1299细胞周期阻滞及凋亡A为不同浓度PEITC对A549、H1299细胞周期的影响;B为不同浓度PEITC对A549和H1299细胞凋亡的影响。

2.3 PEITC上调TFPI-2表达并抑制其甲基化

不同浓度PEITC处理细胞后,细胞内TFPI-2 mRNA及蛋白水平较未处理时显著增高;TFPI-2甲基化酶活性降低,且当PEITC 50 μmol/L时,A549、H1299细胞中甲基化酶活性最低(图3)。

图3 PEITC对TFPI-2表达的影响A为TFPI-2蛋白水平;B为TFPI-2 mRNA表达水平;C为甲基化特异性PCR结果;D为甲基化酶活性。a为P<0.05,与0 μmol/L PEITC处理组同细胞比较;b为P<0.05,与10 μmol/L PEITC处理组同细胞比较;c为P<0.05,与30 μmol/L PEITC处理组同细胞比较。

2.4 PEITC抑制TMPRSS4表达

不同浓度PEITC处理细胞后,TMPRSS4表达水平均显著降低,且呈浓度依赖性(图4A)。荧光素酶报告实验结果显示,经PEITC处理后,细胞TMPRSS4荧光素酶活性均显著降低(图4B)。

图4 PEITC抑制TMPRSS4表达A为TMPRSS4蛋白表达水平;B为TMPRSS4基因活性。a为P<0.05,与0 μmol/L PEITC处理组同细胞比较;b为P<0.05,与10 μmol/L PEITC处理组同细胞比较;c为P<0.05,与30 μmol/L PEITC处理组同细胞比较。

2.5 沉默TFPI-2对细胞增殖的影响

转染组A549、H1299细胞增殖率及TMPRSS4 mRNA均显著高于空白组和siRNA组(图5)。

图5 沉默TFPI-2对A549和H1299细胞增殖和TMPRSS4 mRNA水平的影响A为细胞增殖;B为TMPRSS4 mRNA表达水平。1为空白组;2为siRNA组;3为转染组。a为P<0.05,与空白组同细胞比较;b为P<0.05,与siRNA组同细胞比较。

2.6 过表达TMPRSS4对细胞凋亡的影响

转染pcDNA3.0-TMPRSS4过表达质粒,显示质粒序列与目的序列相同,符合实验要求(图6A、B)。转染pcDNA3.0-TMPRSS4质粒后,A549、H1299细胞凋亡率显著低于空白组、空载体组(图6C)。

图6 过表达TMPRSS4对A549和H1299细胞凋亡的影响A为pcDNA3.0-TMPRSS4过表达质粒测序结果;B为A549和H1299细胞过表达TMPRSS4鉴定结果;C为细胞凋亡。

3 讨 论

PEITC作为人工合成的异硫氰酸化合物,是一种潜在的抗肿瘤药物[7]。尽管尚未应用于临床,但大量研究证实,PEITC能够有效抑制多种肿瘤细胞的增殖、黏附、迁移及侵袭[8-9]。尽管本课题组前期已经证实了PEITC对肺癌细胞增殖的抑制作用,但其抗肺癌的分子机制尚未完全明确。本研究结果显示,PEITC能够通过抑制TFPI-2甲基化下调TMPRSS4表达进而抑制A549和H1299细胞增殖。

肿瘤细胞的增殖分化通常受多种基因的调控,而TFPI-2是目前已知的一种重要的抑癌基因,其具有抑制肿瘤发展、促进细胞凋亡等多种生物学功能[10-11]。研究表明,在肺癌细胞中通过转染方法上调TFPI-2水平后可显著降低细胞的增殖能力,表明TFPI-2是肺癌细胞发生发展过程中的关键因子,也是一个潜在的治疗靶点[12]。本研究采用PEITC处理肺癌细胞后,细胞内TFPI-2表达显著增加,而采用siRNA沉默TFPI-2表达后,PEITC对A549、H1299细胞增殖的抑制作用出现了明显的减弱,提示TFPI-2参与了PEITC对肺癌细胞的调控作用。TFPI-2启动子甲基化是影响TFPI-2体内表达水平的重要因素。而在NSCLC患者体内TFPI-2的甲基化水平较高,并且与肿瘤的预后呈负相关[13]。本研究结果显示,经PEITC处理后,肺癌细胞内TFPI-2的甲基化酶活性以及甲基化状态的TFPI-2均显著降低。因此,PEITC诱导肺癌细胞凋亡可能与细胞内TFPI-2表达增加,TFPI-2启动子甲基化水平降低有关。

TMPRSS4能够参与细胞黏附、增殖、侵袭等多种细胞生物学功能[14-15]。TMPRSS4在多种肿瘤细胞中异常表达。研究表明,TMPRSS4在NSCLC癌组织中的表达水平要显著高于癌旁组织,而下调TMPRSS4的表达则可显著抑制癌细胞的增殖与迁移[7,16]。本研究采用实时定量PCR证实,PEITC能下调A549、H1299细胞中TMPRSS4的表达,从而诱导细胞凋亡。转染pcDNA3.0-TMPRSS4质粒后,细胞凋亡率检测结果验证之前的结论。

综上,PEITC能抑制TFPI-2甲基化,从而下调TMPRSS4表达,影响A549及H1299细胞的增殖活性并诱导其凋亡;提示TFPI-2、TMPRSS4可能是肺癌治疗的新靶点。