微囊藻毒素-LR处理的中性粒细胞NETs促进结直肠癌细胞迁移

张海灵，杨 玉，周倩倩，汪远金，王 婷

1.南京医科大学 基础医学院 细胞生物学系，江苏 南京 211166；2.安徽医科大学 临床医学院，安徽 合肥 230031

微囊藻毒素-LR(microcystin-LR, MC-LR)是蓝藻水华产生的次级代谢产物,对肝脏[1]、肾脏[2]、心脏[3]均具有毒性作用。流行病学研究表明MC-LR与消化道癌发生发展密切相关[4],MC-LR能够通过调节miR-221/PTEN和STAT3信号通路,促进结直肠癌细胞的迁移[5]。

结直肠癌是世界发病率和病死率都较高的恶性消化道肿瘤之一[6],肿瘤的发生发展离不开肿瘤微环境(tumor microenvironment, TME)。TME中肿瘤细胞可以通过释放信号募集中性粒细胞,成为肿瘤相关中性粒细胞后被激活并释放一种由DNA-组蛋白复合物和蛋白质组成的网状结构即NETs[7]。NETs的活化因素有多种,如各种病原体、细胞因子、化学试剂等,然而关于MC-LR对NETs的影响还未见报道。近年来,MC-LR与机体炎性反应关系的研究多见报道,MC-LR可以刺激炎性细胞因子TNF-α、IL-1β和IFN-γ的释放,从而诱导炎性反应[8],而在TME中发生炎性反应对肿瘤自身的进展具有促进作用。因此本研究旨在探究MC-LR能否影响TME中NETs的产生进而促进结直肠癌细胞迁移。

1 材料与方法

1.1 材料

MC-LR(纯度大于95%,ENZO公司);DMEM培养基、胎牛血清、青-链霉素抗生素(ThermoFisher Scientific公司);佛波酯(phorbol 12-myristate 13-acetate,PMA)、氧化偶氮甲烷(azoxymethane,AOM)(Sigma-Aldrich公司);葡聚糖硫酸钠(dextran sodium sulfate,DSS)(MP Biomedicals公司);Transwell小室(Corning公司);NE、citH3、CD11b、Ly6G单克隆抗体(Abcam公司);人结直肠癌细胞系DLD-1和小鼠结直肠癌细胞系CT26(中国科学院细胞库);雄性BALB/c小鼠和裸鼠(南京大学模式动物研究所),实验鼠均饲养于南京医科大学医药实验动物中心SPF级饲养室,动物实验经南京医科大学实验动物伦理委员会批准(伦理编号:2006029)。

1.2 方法

1.2.1 同位素标记相对和绝对定量(isobaric tags for relative and absolute quantification,iTRAQ)技术检测结直肠癌细胞培养上清中分泌蛋白的表达:收取经过MC-LR处理48 h的DLD-1细胞培养上清,即待测蛋白质样品,加入胰蛋白酶酶解,真空冷冻干燥,然后用含0.1% SDS的三乙基碳酸氢铵缓冲液(triethylammonium bicarbonate,TEAB)复溶肽段。将iTRAQ试剂在室温下化冻,800 r/min离心5 min。每管加入相应体积的异丙醇,吹打混匀,加入到消化后的蛋白质样品中。将标记试剂和蛋白质样品吹打混匀后,室温静置2 h,800 r/min离心5 min。将标记好的所有蛋白质样品合并,进行强阳离子交换柱(strong cation exchange,SCX)分离,分离后对样品进行除盐、冻干和复溶,吸取相应体积进行基质辅助激光解吸电离(matrix-assisted laser desorp-tion ionization,MALDI)检测以及高效液相色谱串联质谱法(high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry,HPLC-MS/MS)上样分析。该实验在南京医科大学分析测试中心检测分析。

1.2.2 结直肠癌小鼠移植瘤模型:选取10只5周龄左右裸鼠,随机分为对照组(n=5)和MC-LR处理组(n=5),制备增殖良好的DLD-1细胞悬液,皮下注射到裸鼠左前上肢腋下处,接种细胞数2×106个/只,待肿瘤体积为100 mm3时,MC-LR处理组灌胃40 μg/kg的MC-LR,对照组灌胃0.9%氯化钠溶液,连续灌胃15 d。

1.2.3 流式细胞测量术检测裸鼠肿瘤组织中中性粒细胞数量:将裸鼠皮下肿瘤制得的细胞悬液分为实验管和对照管,每管1×106个细胞,实验管加入PE-CyTM7标记的Ly6G抗体和APC标记的CD11b抗体,避光冰浴20 min,对照管不加抗体。孵育结束后,PBS洗3次,2 000 r/min离心5 min,PBS重悬细胞,上机检测。

1.2.4 AOM/DSS原位结直肠癌小鼠模型:将18只雄性BALB/c小鼠随机分为对照组,AOM/DSS组和MC-LR/AOM/DSS组,每组6只。实验第1天,AOM/DSS组和MC-LR/AOM/DSS组小鼠腹腔注射12.5 mg/kg AOM。6 d后,以饮水给药的方式饲喂AOM/DSS组和MC-LR/AOM/DSS组小鼠2.5% DSS,持续1周后换正常饮水饲喂2周。以饲喂2.5% DSS连续1周和之后换正常饮水饲喂2周作为1个循环,对AOM/DSS组和MC-LR/AOM/DSS组小鼠进行6个循环的实验。对照组小鼠始终饲喂正常饮水。AOM/DSS模型造模成功后,给MC-LR/AOM/DSS组小鼠灌胃40 μg/kg的MC-LR,连续灌胃15 d。对照组和AOM/DSS组小鼠灌胃0.9%氯化钠溶液。

1.2.5 免疫组化实验检测BALB/c小鼠肿瘤组织中NE和citH3的表达:石蜡切片脱蜡水化,加入0.01 mol/L柠檬酸抗原修复缓冲液,高压锅法修复抗原;将切片放入3% H2O2中,室温孵育10 min;PBS洗3次,滴加封闭液,室温孵育1 h;弃封闭液,滴加一抗,4 ℃过夜;PBS洗3次,滴加二抗,室温孵育30 min;PBS洗3次,滴加链霉素抗生物素-过氧化物酶溶液,室温孵育10 min;PBS洗3次,用DAB显色、苏木精复染、二甲苯透明、中性树胶封片,干燥后于显微镜下观察。

1.2.6 中性粒细胞外诱捕网(neutrophils extra-cellular traps,NETs)的制备:取BALB/c小鼠骨髓中性粒细胞,加入100 nmol/L PMA或者100 nmol/L和25 nmol/L MC-LR,培养3～4 h后,去除上清,吹打收集NETs,2 000 r/min离心5 min,弃上清,重复两次,所得悬液即为NETs。

1.2.7 免疫荧光实验检测NETs的形成:将中性粒细胞置于细胞爬片上,每个爬片接种2×105个细胞,100 nmol/L PMA处理4 h;弃培养基,PBS洗爬片3次,加入4%多聚甲醛,室温固定20 min;PBS洗3次,0.5% TritonX-100室温通透20 min;PBS洗3次,5%山羊血清封闭1 h;加入NE或citH3抗体,4 ℃过夜;弃一抗,PBS洗3次,加入带荧光的二抗(Alexa Flour 488),37 ℃孵育1 h;弃二抗,PBS洗3次,DAPI复染20 min;弃DAPI,PBS洗3次,防淬灭剂封片观察。

1.2.8 Transwell小室法检测细胞迁移能力:将CT26细胞接种于Transwell小室中,每孔3×104个细胞,用制备好的NETs处理CT26细胞。下室加入600 μL含10%胎牛血清的培养基,48 h后将小室置于4%多聚甲醛中固定15 min,在5%结晶紫中染色15 min,用棉签轻拭去小室滤膜上的细胞,在倒置显微镜下拍照。将小室置于33%乙酸中裂解,在570 nm波长处检测裂解液的吸光度值,间接反映细胞数。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 MC-LR对结直肠癌细胞分泌蛋白表达的影响

与对照组相比,MC-LR处理之后的DLD-1细胞培养上清有76个差异表达的蛋白(图1A),其中有11个差异表达的蛋白具有统计学意义(P<0.05),在这11个差异表达的蛋白中表达上调的有8个,表达下调的有3个。这11个差异表达的蛋白质基因富集在与白细胞迁移有关的信号途径上(图1B)。

A.cluster heat map of differentially expressed proteins treated by MC-LR; B.GO enrichment analysis of differentially expressed proteins.图1 MC-LR对DLD-1细胞分泌蛋白质的影响Fig 1 Effect of MC-LR on proteins secreted by DLD-1 cells(n=3)

2.2 MC-LR增加肿瘤组织中中性粒细胞的数量

经过MC-LR处理的裸鼠肿瘤组织中中性粒细胞的比率较对照组增多(图2)。

A.Ctrl.control group of xenograft mice; MC-LR.MC-LR treated group xenograft mice; B.statistical chart of neutrophil percentage; *P<0.05 compared with control.图2 流式细胞测量术检测MC-LR对裸鼠异种移植肿瘤组织中中性粒细胞募集的影响Fig 2 Effect of MC-LR on neutrophil recruitment in colorectal cancer tissues of xenograft nude mice detected

2.3 MC-LR增加原位肿瘤中NETs的形成

AOM/DSS和MC-LR/AOM/DSS组小鼠结直肠肿瘤组织中CD11b、NE和citH3的表达均较对照组显著增多。而MC-LR/AOM/DSS处理组小鼠肿瘤组织中CD11b、NE和citH3的表达较AOM/DSS组增高(图3)。

Colorectal tumor tissues of corresponding treatment group detected by immunohistochemistry (×200), AOD.average optical density; *P<0.01 compared with control, #P<0.01 compared with AOM/DSS.图3 MC-LR对原位结直肠肿瘤组织中中性粒细胞募集及NETs形成的影响Fig 3 Effect of MC-LR on neutrophil recruitment and NETs formation in colorectal tumors in n=3)

2.4 MC-LR处理的NETs增强结直肠癌细胞的迁移能力

在中性粒细胞周围发现NE和citH3的荧光标记说明在体外诱导产生了NETs(图4A,B)。

图4 免疫荧光检测NETs标志物NE和citH3的表达Fig 4 Detection the expression of NETs markers NE and citH3 by immunofluorescence (×630)

MC-LR和NETs分别处理结直肠癌细胞后均能促进其迁移,而经过MC-LR处理的NETs对结直肠癌细胞迁移的促进作用更强(图5A,B)。

A.the effects of NETs and MC-LR on CT26 cell migration detected by Transwell assay (×40); B.the A value of translocated CT26 cells, *P<0.01 compared with control, #P<0.01 compared with NETs.图5 MC-LR处理的NETs对CT26细胞迁移的影响Fig 5 Effects of NETs treated with MC-LR on the migration of CT26 n=3)

3 讨论

MC-LR对肿瘤的发生发展有一定的促进作用[9]。结直肠癌是一种常见的消化道恶性肿瘤,具有较高的发病率和病死率[10]。肿瘤的生长离不开TME,在TME中存在大量的肿瘤相关中性粒细胞,而MC-LR具有募集并激活中性粒细胞的作用[11],这与本研究的实验结果相符。本研究表明MC-LR增加了肿瘤组织中中性粒细胞的数量,且使得与白细胞迁移有关过程的蛋白质表达发生改变,说明MC-LR有可能通过促进肿瘤细胞分泌炎性因子,从而募集中性粒细胞。

MC-LR增加了TME中中性粒细胞的募集,而中性粒细胞发挥作用的方式有多种,其中NETs的形成是其发挥免疫学功能的重要方式之一。NETs是中性粒细胞在各种因子的刺激下向细胞外释放的一种纤维网状结构,主要由DNA和多种酶组成[12]。在体外采用PMA诱导可以促使中性粒细胞产生NETs,然而关于MC-LR对NETs形成的影响未见报道。NETs可以对TME中肿瘤细胞的生物学特性、免疫细胞杀伤肿瘤的能力以及细胞外基质的组分等方面产生作用进而影响肿瘤的生存与发展,因此NETs对肿瘤细胞的影响是多方面的,中性粒细胞释放的NETs能够促进肿瘤的侵袭转移[13]。而MC-LR对肿瘤进展的促进作用也多有报道,本研究中采用MC-LR处理过的NETs作用于结直肠癌细胞,结果发现MC-LR处理之后的NETs显著增加了结直肠癌细胞的迁移数量。在NETs中存在两种主要的蛋白NE和MMP9,它们可以裂解层黏连蛋白,蛋白水解重塑的层黏连蛋白通过激活整合素α3β1信号通路诱导休眠癌细胞的增殖[14]。此外中性粒细胞能够增加MMP9的释放来促进肿瘤的迁移[15]。所以MC-LR有可能通过增加NETs中MMP9的释放促进肿瘤的进展,具体通过怎样的分子机制还有待进一步探究。

综上所述,本研究证明了MC-LR能够增加结直肠癌细胞对中性粒细胞的募集,并可能通过诱导NETs的形成进而促进结直肠癌细胞的迁移,拓展了对MC-LR促肿瘤作用机制的认识。