冷杉梢斑螟化学感受蛋白DabiCSP8的配体结合特性分析

朱垚龙 王政全 吴春 尹宁娜 刘乃勇

摘要

采用分子生物学和荧光竞争性结合测定等技术，研究了冷杉梢斑螟Dioryctria abietella雌虫性腺和雌、雄成虫足中高表达的化学感受蛋白DabiCSP8基因的表达特征和功能。定量分析结果表明，DabiCSP8基因在雌蟲性腺中显著高表达，表达量分别是雌、雄虫触角的1 232.27倍和3 130.64倍;此外，该基因在雌、雄成虫足中表达量也较高。通过原核表达系统及亲和层析技术获得了13.64 kD的目的蛋白DabiCSP8。结合测定结果表明，DabiCSP8与探针N苯基1萘胺（1NPN）具有强的结合能力，结合常数（K1NPN）为（1.61±0.02）μmol/L。β紫罗兰酮是DabiCSP8的最佳结合配基，解离常数（Kd）为（11.43±0.62）μmol/L。DabiCSP8结合腔内的极性氨基酸精氨酸46（Arg46）能够与β紫罗兰酮形成两个氢键，暗示Arg46在该化合物的结合中起着重要作用。此外，DabiCSP8与部分杀虫剂具有中等强度的结合能力。

关键词

冷杉梢斑螟; 化学感受蛋白; 结合测定; β紫罗兰酮; 分子对接

中图分类号：

S 763.3

文献标识码： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2022171

Ligand binding property of chemosensory protein 8 （DabiCSP8） of Dioryctria abietella

ZHU Yaolong， WANG Zhengquan， WU Chun， YIN Ningna， LIU Naiyong*

（Key Laboratory of Forest Disaster Warning and Control of Yunnan Province， Southwest Forestry University， Kunming 650224， China）

Abstract

In this study， the expression profiles of DabiCSP8 and binding properties of DabiCSP8 enriched in female pheromone glands and female and male legs of Dioryctria abietella were characterized using molecular biological methods and fluorescence competitive binding assays. Quantitative realtime PCR results revealed that the expression of DabiCSP8 was significantly higher in female pheromone glands compare to other tissues， which was 1 232.27 and 3 130.64fold higher than that in female and male antennae， respectively. In addition， the high expression of DabiCSP8 was also detected in female and male legs. By prokaryotic recombinant expression and affinity chromatography， DabiCSP8 was expressed and purified with the expected size of 13.64 kD. Binding assays showed that DabiCSP8 could strongly bind to Nphenyl1naphthylamine （1NPN） with a binding constant （K1NPN） of （1.61±0.02）μmol/L. Among the 100 tested compounds， βionone was the best ligand for DabiCSP8 with a dissociation constant （Kd） of （11.43±0.62）μmol/L. In the binding cavity of DabiCSP8， the polar amino acid residue arginine 46 （Arg46） was able to form two hydrogen bonds with βionone， suggesting the importance of Arg46 in the binding of DabiCSP8 to βionone. In addition， DaciCSP8 exhibited moderate binding affinities to some insecticides.

Key words

Dioryctria abietella; chemosensory protein; binding assay; βionone; molecular docking

梢斑螟属Dioryctria害虫多以幼虫钻蛀针叶树球果和嫩梢为害，造成枝梢枯死和种子减产，严重影响林木的生长和木材质量。近年来，该属害虫呈扩散和为害加重的趋势，已由一般害虫逐步上升为松科重要害虫，在局部地区造成巨大损失。目前，国内梢斑螟类害虫的防治主要以化学防治和营林技术为主，生物防治和物理防治為辅。由于梢斑螟属害虫个体小、钻蛀性强、生活隐蔽、成虫飞翔能力强以及松树植株树势高等特点，导致此类害虫的防治难度较大［12］。针对蛾类昆虫的生理和行为特点，研发基于嗅觉的行为调控剂是监测和防治梢斑螟属害虫的一种重要策略［34］。

化学感受蛋白（chemosensory proteins， CSPs）是一类在昆虫嗅觉感受过程中起重要作用的蛋白，在雌雄虫触角、足、跗节、胸、腹、翅和雌虫性腺等多个组织中均有表达，暗示昆虫CSPs具有多种功能［5］。在梨小食心虫Grapholita molesta中，成虫触角和翅中高表达的GmolCSP8与1己醇具有较强的结合能力［6］。类似地，CSPs参与嗅觉感受在其他鳞翅目昆虫中也有报道，如黏虫Mythimna separata的MsepCSP8和MsepCSP14［78］、稻纵卷叶螟Cnaphalocrocis medinalis的CmedCSP33［9］、家蚕Bombyx mori的BmorCSP1和BmorCSP2［10］。除能够结合普通气味分子外，昆虫CSP还能通过结合杀虫剂来提高害虫的抗药能力。冈比亚按蚊Anopheles gambiae足中高表达的AgamSAP2（sensory appendage protein 2）被证实能与拟除虫菊酯类杀虫剂结合，提高蚊子的抗性［11］。在鳞翅目昆虫中，SlitCSP18能提高斜纹夜蛾Spodoptera litura对毒死蜱的抗性［12］;用阿维菌素处理家蚕后，多个CSP基因在雌虫触角、足、肠道、脂肪体、性腺等组织中的表达水平显著上调或下调［13］。此外，研究发现鳞翅目昆虫CSP基因在雌虫性腺中有表达，很可能参与性信息素的转运和释放。然而，目前对雌虫性腺中高表达CSPs的功能研究仍较少。甘蓝夜蛾Mamestra brassicae雌虫性腺中高表达的MbraCSPA和MbraCSPB能够与性信息素组分顺11十六碳烯乙酸酯和顺11十八碳烯乙酸酯结合，并将其释放到环境中［14］。

冷杉梢斑螟Dioryctria abietella是一种为害松科植物球果和嫩梢的钻蛀性害虫;与梢斑螟属其他昆虫类似，防治该种害虫的各种方法不易实施［12］。先前，冷杉梢斑螟的性信息素组分已被鉴定，分别为顺9，反11十四碳二烯乙酸酯（Z9，E11tetradecadienyl acetate， Z9，E1114：OAc）和（Z3，Z6，Z9，Z12，Z15）pentacosapentaene［1516］。基于性信息素和寄主植物挥发物在冷杉梢斑螟生理和行为中的重要性，采用以性信息素或植物挥发物为诱芯或驱避剂的方法可以很好地监测和控制害虫种群，提高防治效果和降低防治成本。然而，冷杉梢斑螟雌雄虫间、其与寄主或非寄主植物间互作的分子机制研究仍较少。本研究以冷杉梢斑螟为对象，采用分子生物学、结合测定和分子对接等技术研究了雌虫性腺和雌雄成虫足中高表达DabiCSP8的功能，初步明确了与冷杉梢斑螟DabiCSP8结合能力较强的配基，旨在为后续该种害虫引诱剂或驱避剂的研发奠定基础。

1 材料与方法

1.1 昆虫和组织收集

冷杉梢斑螟幼虫和蛹采自云南省楚雄市紫溪山风景区（101°22′E，25°00′N）。将被冷杉梢斑螟为害的华山松球果带回实验室，用尼龙网套住。在成虫羽化当天将其全部移出，根据腹部外生殖器特征鉴别雌雄成虫，并将其分别放入不同的饲养笼中，饲以10%的蜂蜜水。饲养温度为（25±1）℃，相对湿度为（60±5）%，光周期为L∥D=12 h∥12 h。

为了研究冷杉梢斑螟DabiCSP8基因的表达谱，分别收集3日龄雌雄成虫触角（30头）、喙（50头）、头（不含触角和喙，10头）、胸（4头）、腹（雌虫不含性腺、雄虫不含味刷，4头）、足（20头）、翅（30头）、雄虫味刷（30头）和雌虫性腺（含产卵器，30头），每个组织收集3套生物学模板，液氮速冻后保存于-80℃用于RNA的提取。

1.2 总RNA提取和cDNA的合成

采用TRIzol试剂（TaKaRa， 大连， 中国）提取各组织总RNA，经琼脂糖凝胶电泳和NanoPhotometer分光光度计（IMPLEN， 美国）检测RNA质量和浓度后，采用PrimeScriptTM RT Reagent Kit with gDNA Eraser（TaKaRa， 大连， 中国）合成cDNA。其中，RNA样品中的基因组DNA用试剂盒中的gDNA Eraser去除，反应程序为：42℃孵育2 min。cDNA储存于-20℃。

1.3 DabiCSP8基因的表达谱分析

根据已发表的DabiCSP8基因的核苷酸序列［17］设计特异引物（上游引物：5′TGGAGAGGACACATAACAG3′;下游引物：5′GCCTTCAGGGTCATACTT3′）。采用实时荧光定量PCR研究DabiCSP8基因在不同组织中的相对表达量。反应体系为20 μL，包括Bestar SybrGreen qPCR Mastermix（DBI Bioscience， 德国）10 μL，cDNA 2 μL，10 μmol/L上、下游引物各0.5 μL， ddH2O 7 μL。反应程序为：95℃预变性2 min;95℃变性10 s，58℃退火31 s，72℃延伸30 s，共40个循环。反应结束后采集循环阈值（cycle threshold， Ct）。利用QGene法计算DabiCSP8基因在不同组织的相对表达量［1819］。以冷杉梢斑螟核糖体蛋白S4（ribosomal protein S4， DabiRPS4）和L8（DabiRPL8）作为内参基因［17］。定量分析中每个组织采用3套生物学模板，每套模板3次重复。

采用IBM SPSS Statistics 21.0（SPSS Inc.， 美国）软件中的Fisher最小显著差异检验（Fishers least significant difference test， LSD）比较基因在不同组织间的表达水平。当P < 0.05时，基因在两个组织间的表达水平被认为具有显著差异。

1.4 DabiCSP8表达载体的构建

基于DabiCSP8基因的开放阅读框，首先利用SignalP 4.1预测DabiCSP8的信号肽序列［20］。其次，根据预测结果移除DabiCSP8的N端前18个氨基酸的信号肽序列，设计基因特异性引物，并在引物5′端加入酶切位点和保护碱基（上游引物：5′CGGGATCCCTCCCTAAGGAGTACTACACAGACA3′;下游引物：5′CCCAAGCTTTTAGGAGCTACCGGTGAAGAGT3′，其中下划线分别为上游引物BamHⅠ和下游引物Hind Ⅲ的酶切位点）。第三，以雌虫性腺cDNA为模板，采用高保真酶PrimeSTAR Max DNA聚合酶（TaKaRa， 大连， 中国）扩增DabiCSP8基因，程序为：98℃预变性2 min;98℃变性10 s，60℃退火10 s，72℃延伸50 s，35个循环; 72℃延伸10 min。最后，采用HiPure Gel Pure DNA Mini Kit（Magen， 广州， 中国）纯化目的基因的PCR产物。

分别用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ酶切纯化的PCR产物和原核表达载体pET30a （+），在16℃，用T4 DNA连接酶连接30 min构建重组质粒pET30a （+）/DabiCSP8，将连接产物转化至DH5α感受态细胞，LB固体平板培养基涂板，挑取单克隆进行测序验证。

1.5 DabiCSP8的表达和纯化

将测序验证正确的重组质粒pET30a （+）/DabiCSP8转化到BL21（DE3）感受态细胞中。挑取单克隆至LB液体培养基（Kan+， 50 μg/mL）中，37℃，200 r/min振荡培养过夜;将活化的菌液按1∶50的比例接入新鲜的LB液体培养基中进行扩大培养（1 L），当OD600 ≈ 0.6时，加入终浓度为1 mmol/L異丙基βD硫代半乳糖苷（isopropyβDthiogalactoside， IPTG）继续诱导培养6～7 h。取1 mL诱导菌液，采用全自动样品快速研磨仪进行机械破碎，破碎3次，每次5 min，破碎结束后离心取上清和沉淀，用SDSPAGE电泳检测目的蛋白的可溶性表达情况，剩余诱导菌液用于目的蛋白的纯化。

根据电泳检测结果，DabiCSP8主要以包涵体的形式表达，因此采用蛋白变性和复性的方法纯化蛋白。首先，根据Ni Sepharose High Performance（GE Healthcare）说明书，采用亲和层析技术纯化重组蛋白。其次，利用尿素浓度梯度递减的缓冲液（6、4、3、2、1、0 mol/L）进行透析复性。而后，采用肠激酶切除重组蛋白的His标签，再次利用亲和层析技术纯化目的蛋白。最后，目的蛋白经透析除盐，浓缩至合适浓度后存于-80℃。

1.6 DabiCSP8与不同化合物的结合测定

用于结合测定的荧光探针N苯基1萘胺（Nphenyl1naphthylamine， 1NPN）、植物源挥发物、性信息素和杀虫剂购自Aladdin或SigmaAldrich公司，为分析标准品或纯度大于90%。所有化合物均用色谱级甲醇溶解，配成100 mmol/L的储存液，保存于-20℃，待使用时稀释至1 mmol/L。

为了确定1NPN是否能够用于DabiCSP8的荧光竞争性结合测定，在比色皿中加入20 mmol/L的TrisHCl缓冲液（pH 7.4）和终浓度为2 μmol/L的1NPN，检测发射波长460 nm附近的荧光峰值。然后，加入终浓度为2 μmol/L纯化的DabiCSP8，观察荧光峰值的变化情况。如果荧光峰发生蓝移，且荧光强度成倍增加，说明1NPN能够与DabiCSP8结合。在结合测定中，首先测定DabiCSP8与1NPN的结合情况，即在20 mmol/L的TrisHCl缓冲液（pH 7.4）和终浓度为2 μmol/L的目的蛋白混合液中分别加入不同终浓度的1NPN（2、4、5、8、12、16 μmol/L）。如果1NPN与目的蛋白的结合具有饱和效应，则可用于后续的荧光竞争性结合试验。参数设定：激发光波长Ex=337 nm，激发和发射狭缝分别为3 nm和5 nm，发射光波长 Em=350～500 nm。

在竞争性结合测定中，将20 mmol/L的TrisHCl缓冲液（pH 7.4），终浓度分别为2 μmol/L DabiCSP8和1NPN加入比色皿中混合均匀。然后，分别加入不同浓度的供试化合物使其终浓度为2、4、5、8、12、16、20 μmol/L，记录发射波长在398 nm处的荧光峰值变化。在化合物终浓度为20 μmol/L 时，对于荧光取代率［熒光取代率=（1-荧光下降值/起始荧光值）×100%］在45%以上的化合物，试验重复3次。DabiCSP8与1NPN的结合常数（binding constant， K1NPN）采用GraphPad Prism 7.0进行计算。然后，根据IC50（替换50%的1NPN时竞争化合物的浓度）计算DabiCSP8与化合物的解离常数（dissociation constant， Kd）。Kd=IC50/（1+［1NPN］/K1NPN），其中［1NPN］为游离的1NPN浓度［21］。

1.7 DabiCSP8的同源模拟和分子对接

DabiCSP8的三级结构建模采用SWISSMODEL在线软件（https：∥swissmodel.expasy.org/）完成。首先，用去除信号肽的DabiCSP8氨基酸序列搜索同源建模的晶体模板，发现其与沙漠蝗Schistocerca gregaria的SgreCSP4序列具有较高的氨基酸一致性。然后，以SgreCSP4的晶体结构作为模板（PDB ID：2GVS）［22］，构建DabiCSP8的三级结构。采用AutoDock Vina 1.1.2软件进行DabiCSP8与化合物的分子对接［23］。三级结构的可视化和编辑采用PyMOL 1.7.2.1软件完成（https：∥pymol.org/2/）。

2 结果与分析

2.1 DabiCSP8基因的组织表达谱分析

根据转录组测序获得的FPKM（fragments per kilobase of transcript sequence per millions base pairs sequenced）值和化感基因半定量的结果，DabiCSP8基因在雌虫性腺中表达量最高，其次是雌虫足，2个组织间FPKM值相差5.65倍［17］。本研究中定量分析表明，DabiCSP8基因在雌虫性腺中显著高表达，表达量分别是雄虫足、雌虫足、雄虫喙、雄虫味刷和雌虫喙的5.77、6.14、54.30、61.50倍和83.94倍。与转录组测序结果基本一致。此外，该基因在雌雄虫触角和其他组织中也有微弱表达，且在雌虫触角的表达量显著高于雄虫，但雌、雄虫触角表达量分别仅为雌虫性腺的1/1 250和3/10 000。在雌雄虫足、喙、头、胸或腹间，DabiCSP8基因的表达水平无显著差异;而在雄虫翅中的表达量显著高于雌虫（图1）。

2.2 DabiCSP8的表达和纯化

SDSPAGE分析结果表明，经IPTG诱导后的重组蛋白pET30a （+）/DabiCSP8在约20 kD处具有一条明显加粗的条带，与预测的分子量大小（19.64 kD）一致。对IPTG诱导后的菌液机械破碎后发现DabiCSP8主要以包涵体的形式表达。对重组蛋白进行纯化和切除His标签后，得到13.64 kD的单一目的蛋白条带（图2）。

2.3 DabiCSP8与不同化合物的结合特性

1NPN能够很好地与DabiCSP8结合，结合常数K1NPN为（1.61±0.02）μmol/L（图3a）。随着1NPN浓度的增加，DabiCSP8与其结合接近饱和，采用Scatchard线性化后发现DabiCSP8蛋白与1NPN的结合具有较好的线性关系（图3a，3b）。

竞争性结合测定结果表明，DabiCSP8与大部分化合物的结合能力较低。在测试的100种化合物中，β紫罗兰酮是DabiCSP8的最佳配基，解离常数Kd为（11.43±0.62）μmol/L;而其他化合物的荧光取代率均在50%以下（图3c，表1）。在测试的7类化合物中，酯类化合物中2，4癸二烯酸乙酯与DabiCSP8结合能力最强，荧光取代率为30.61%;醇类化合物中3甲基2丁烯1醇和庚醇的荧光取代率分别为38.53%和32.30%;醛类化合物中丁香醛和十二醛的荧光取代率在30%以上;而烯烃类和烷烃类化合物与DabiCSP8结合能力均较弱（荧光取代率小于30%）;此外，DabiCSP8与杀虫剂辛硫磷和毒死蜱的结合能力较强，荧光取代率分别为47.74%和37.87%（图3d，表1）。

2.4 DabiCSP8与β紫罗兰酮互作的关键位点预测

同源搜索结果表明，冷杉梢斑螟DabiCSP8与沙漠蝗的SgreCSP4的氨基酸一致性最高，为47.71%。DabiCSP8的二级结构主要由6个α螺旋组成：α1（位点15-20）、α2（位点22-33）、α3（位点40-54）、α4（位点62-78）、α5（位点80-90）和α6（位点97-103），其中两个CSP间α1高度保守，除丝氨酸（S）外，其余氨基酸完全一致;α2、α5和α6的一致性也较高，分别为50.00%、63.64%和60.00%;剩余的两个α螺旋一致性在50%以下，其中α4的一致性仅为35.29%（图4a）。

根据结合测定结果，选取与DabiCSP8结合能力最好的配基β紫罗兰酮进行分子对接，鉴定与该化合物结合的关键氨基酸。结果表明，DabiCSP8结合腔4 内有9个氨基酸与β紫罗兰酮结合，包括8个非极性氨基酸：异亮氨酸29（Ile29）、色氨酸45（Trp45）、Ile49、Ile72、甲硫氨酸75（Met75）、Trp83、Ile86和Trp90;1个极性氨基酸：精氨酸46（Arg46）。其中，β紫罗兰酮的氧（O）能够与Arg46形成两个氢键，氢键距离分别为3.08和3.15（图4b）。

3 结论与讨论

冷杉梢斑螟是松属植物上一种重要的钻蛀性害虫，雌虫常将卵产于寄主植物球果鳞片上或嫩梢处，卵孵化成幼虫后钻蛀球果，对种子和木材质量造成较大影响［2， 24］。在鳞翅目昆虫的成虫中，雌虫的性腺和雌雄虫的跗节是感受和识别各种化合物的重要器官，其表达的化学感受相关蛋白（如CSP）在蛾类的生存和繁衍中具有重要作用［5， 25］。基于已鉴定的冷杉梢斑螟CSP基因及其表达谱结果［17］，本研究选取在雌虫性腺和雌雄成虫足中高表达的DabiCSP8基因，研究了它与100种化合物的结合特性，探讨了DabiCSP8与最佳结合配基β紫罗兰酮的结合机制。研究结果明确了DabiCSP8的气味结合谱，可为后续冷杉梢斑螟行为调控剂的研究提供借鉴。

在定量分析中，DabiCSP8基因的定量结果与转录组测序得到的FPKM值结果一致，即该基因在雌虫性腺中显著高表达，是性腺中具有最高FPKM值的CSP基因，其中雌虫性腺与雌虫足、雌虫性腺与雌虫触角间的表达量差异倍数与已发表结果基本一致［17］。Xing等［26］对冷杉梢斑螟雌虫性腺进行了转录组测序，但是仅鉴定到1个CSP基因（DabiCSP1），未发现本研究中的DabiCSP8基因。综合已发表的转录组测序和半定量结果［17］以及本研究中定量PCR结果，认为DabiCSP8基因在雌虫性腺中有表达。而Xing等［26］的雌虫性腺转录组未鉴定到该基因很可能是由于组装错误或者鉴定遗漏导致。为了验证以上猜测，我们用DabiCSP8基因的核苷酸序列作为靶标，采用MEGA BLAST同源搜索的方法在NCBI SRA（national center for biotechnology information sequence read archive）序列數据库搜索冷杉梢斑螟的雌虫性腺转录组（登录号：SRX4329669）［26］，结果发现在该转录组中有DabiCSP8基因的核苷酸序列，证实了该性腺转录组中DabiCSP8基因组装错误或者鉴定遗漏的假设。

蛾类雌虫的性腺是产生性信息素的重要器官，研究发现雌虫性腺中的CSP蛋白可能参与性信息素的转运和释放，是雌虫性腺中一类重要的运载蛋白［3， 14］。本研究中DabiCSP8与雌虫性信息素组分Z9，E1114：OAc的结合能力很弱（在20 μmol/L时的荧光取代率为11.70%），说明DabiCSP8可能结合其他性信息素，如（Z3，Z6，Z9，Z12，Z15）pentacosapentaene［16］。DabiCSP8与多种杀虫剂的结合测定显示，辛硫磷和毒死蜱与该蛋白的亲和力最高。在禾谷缢管蚜Rhopalosiphum padi中，RpadCSP5和RpadCSP10基因的沉默导致了吡虫啉处理的蚜虫死亡率显著增加;RpadCSP4和RpadCSP6基因的沉默则同时引起吡虫啉和高效氯氰菊酯处理的蚜虫死亡率显著增加［27］。棉蚜Aphis gossypii的AgosCSP5 ［28］、中华蜜蜂Apis cerana的AcerCSP1 ［29］和小菜蛾Plutella xyllostella的PxylCSP8 ［30］基因与其对吡虫啉的抗性有关。除吡虫啉外，其他有机磷类杀虫剂也与化学感受相关蛋白具有较强的结合能力，如二点委夜蛾Athetis lepigone的AlepGOBP2、AlepPBP2和AlepPBP3与毒死蜱和辛硫磷［3132］。而冈比亚按蚊足中高表达的一个CSP基因（AgamSAP2）被证实与其对拟除虫菊酯类杀虫剂的抗性有关［11］。根据DabiCSP8基因在足中高表达，并且其与有机磷类杀虫剂的结合能力较强，推测冷杉梢斑螟可能通过足高表达DabiCSP8降低害虫对杀虫剂的敏感性。

在测定的化合物中，β紫罗兰酮是DabiCSP8的最佳配基，说明该种化合物可能在冷杉梢斑螟的行为调控中起作用。β紫罗兰酮是植物花分泌的重要挥发性成分，中华蜜蜂的AcerCSP3与该化合物具有强结合能力，说明其可能在蜜蜂寻找蜜源的过程中发挥重要作用［3334］。气相色谱质谱联用技术检测到云南松及其近缘种中含有β紫罗兰酮［35］。鉴于本研究在收集雌虫性腺时也包含了产卵器，加之雌虫产卵器上具有嗅觉感受器及化学感受相关的基因［3637］，冷杉梢斑螟雌虫产卵器中是否存在DabiCSP8基因以及其在感受β紫罗兰酮中的作用值得深入研究。

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