交变磁场对植物乳杆菌固态发酵花粉蛋白质的影响

董彩文 王明雷 何梦宇 蔡祎珂 胡梦潇 魏涛

摘要：采用弱交变磁场辅助优化植物乳杆菌固态发酵油菜蜂花粉，通过单因素试验分别考察了发酵温度、植物乳杆菌菌液浓度、磁场处理时间、磁场强度对蜂花粉固态发酵的影响。响应面优化结果表明，当发酵温度为35 ℃、菌液OD值为1.0、磁场处理时间为4.28 h、磁场强度为3.3 mT时，此条件下发酵后花粉提取液中的蛋白含量为9.534 mg/g，较空白组提高了44.1%，且与优化条件下得到的理论值相差较小，说明优化结果可靠。

关键词：交变磁场；固态发酵；植物乳杆菌；响应面設计

中图分类号：TS202.3      文献标志码：A     文章编号：1000-9973（2023）05-0189-05

Abstract： Using weak alternating magnetic field as an auxiliary way to optimize the solid-state fermentation of rape bee pollen by Lactobacillus plantarum， the effects of fermentation temperature， solution concentration of Lactobacillus plantarum， magnetic field treatment time and magnetic field intensity on the solid-state fermentation of bee pollen are investigated by single factor test. The results of the response surface optimization show that when the fermentation temperature is 35 ℃， the OD value of the bacterium solution is 1.0， the magnetic field treatment time is 4.28 h， and the magnetic field intensity is 3.3 mT， the protein content in the pollen extract after fermentation under such conditions is 9.534 mg/g， which is 44.1% higher than that in the blank group. The difference between the theoretical value and practical value is small， indicating that the optimized results are reliable.

Key words： alternating magnetic field; solid-state fermentation; Lactobacillus plantarum; respone surface design

收稿日期：2022-11-29

基金项目：2021年度中原科技创新领军人才项目（224200510017）；郑州轻工业大学食品科学与工程特色骨干学科群高水平成果培育项目；郑州轻工业大学校第十一批校级大学生创新实验项目

作者简介：董彩文（1970-），男，教授，博士，研究方向：食品生物技术。

*通信作者：魏涛（1980-），男，教授，博士，研究方向：食品酶技术开发与应用。

蜂花粉主要是工蜂在采集花蜜和花粉时，自身携带的正电荷与花朵的负电荷产生静电场，从而能吸附花粉粒，再由蜜蜂唾液分泌物黏结而成的花粉团[1-2]。蜂花粉营养价值高，含有人类必需氨基酸及很多活性成分，如蛋白质、多糖、不饱和脂肪酸、黄酮等，且具有较强的抗氧化活性[3-5]。蜂花粉不仅能为人们提供营养，而且具有预防肿瘤、预防前列腺炎、降血糖、血脂等特性[6-7]。

近年来，以蜂花粉作为食品添加剂的产品层出不穷，如蜂花粉面包、蜂花粉饮料、蜂花粉酸奶、蜂花粉啤酒等。将蜂花粉添加到食品中，既能提高产品的营养价值，又能起到调节产品风味的作用[8]。但是，蜂花粉的细胞壁坚硬，直接添加在食品中既影响蜂花粉内容物的释放，又会影响人体对营养成分的吸收[9]。因此，对花粉进行破壁处理能够提高花粉作为食品添加剂的效率。目前常用的蜂花粉生物破壁的方法是微生物发酵破壁，微生物发酵是处理蜂花粉的核心环节，发酵的条件、方式都会直接影响蜂花粉发酵前后营养物质的变化[10]。目前大多数蜂花粉发酵工艺的探究中以蜂花粉的液态发酵为主，对蜂花粉进行固态发酵的研究鲜有报道。

磁场辅助微生物发酵技术成为人们日益关注的研究方向，研究表明弱交变磁场应用于生物发酵过程中能促进生物量及其有益代谢产物的积累[11-13]。低频磁场辅助酿酒酵母发酵可使乙醇产量提高17%[14]，也可促进乳酸菌发酵，使乳酸链球菌产量增加[15]。研究发现弱磁场对微生物酶的作用是确切的，其中弱磁场能够影响微生物细胞酶活性和离体酶活性进而提高微生物的发酵效率[16]，是一种极具开发潜力的辅助发酵方式。目前文献中尚未发现利用弱交变磁场辅助蜂花粉进行固态发酵。

因此，本研究通过弱交变磁场辅助植物乳杆菌用于蜂花粉的固态发酵，经过单因素考察不同因素对发酵前后花粉提取液中蛋白含量的影响，然后选择响应面优化工艺条件，并对优化结果进行了验证。该试验通过研究发酵前后蜂花粉中有益成分的变化，旨在提高花粉作为添加剂的效率，为今后生产蜂花粉产品提供部分理论基础。

1 材料和方法

1.1 材料

油菜蜂花粉：购于河南省长葛市；植物乳杆菌：实验室保藏。

1.2 试剂

磷酸（分析纯）：天津市永大化工试剂制造厂；考马斯亮蓝试剂G-250（分析纯）：郑州派尼化学试剂厂；牛血清蛋白（生物试剂）：北京索莱宝科技有限公司。

1.3 主要仪器与设备

磁场冷冻冷藏箱 英都斯特（无锡）感应科技有限公司；SW-CJ-2FD型洁净工作台 苏净集团苏州安泰空气技术有限公司；LX-C35L型立式自动电热压力蒸汽灭菌器 合肥华泰医疗设备有限公司；ZHP-250型立式恒温振荡培养箱 上海鸿都电子科技有限公司。

1.4 方法

1.4.1 培养基的制备

MRS液态培养基：按照MRS液态培养基配方，配好后于121 ℃灭菌20 min，冷却备用。

1.4.2 菌种的培养

在超净工作台上将冻存在甘油中的植物乳杆菌接种于10 mL MRS液态培养基中，35 ℃恒温摇床培养12 h。吸取菌悬浊液0.1 mL，将其稀释后涂布于MRS平板上，置于35 ℃的生化培养箱中培养12 h。然后挑取单菌落到100 mL MRS液体培养基中，35 ℃条件下摇床培养12 h。

1.4.3 蛋白含量的测定

1.4.3.1 蛋白标准曲线的绘制[17]

参照聂昌宏等的方法测粗蛋白，稍作修改。采用考马斯亮蓝G-250比色法，标准品采用牛血清蛋白，制成0.1 mg/mL的标准蛋白质溶液。

1.4.3.2 花粉提取液中蛋白的制备及测定

取1 g发酵后的花粉，加入10 mL蒸馏水，置于恒温水浴振荡器中，35 ℃水浴振荡1 h。取出样品溶液8 000 r离心10 min，取0.1 mL上清液，参照1.4.3.1的操作方法测其吸光度，蛋白含量计算见下式：

ρ=m×vm1×v1。

式中：ρ为蛋白含量，mg/g；m为根据标准曲线求得的蛋白质量，mg；v为提取液的总体积，mL；m1为样品鲜重，g；v1为测定时取用提取液的体积，mL。

1.4.3.3 发酵温度对花粉蛋白含量的影响

在超净工作台上取灭菌花粉分别放入12个锥形瓶中，每瓶20 g，然后依次加入菌液2.5 mL，无菌水5 mL，搅匀，分别在31，33，35，37，39 ℃条件下培养8 d。每个条件处理2瓶，作为平行试验；空白组用MRS液体培养基代替菌悬浊液，其他条件与试验组一致。按照1.4.3.2的方法进行蛋白含量的测定。

1.4.4 菌液浓度对花粉蛋白含量的影响

在超净工作台上取灭菌花粉分别放入12个锥形瓶中，每瓶20 g，分别加入OD值为0.7，1.0，1.3，1.6，1.9的菌液2.5 mL，无菌水5 mL，在35 ℃条件下培养8 d。每个条件处理2瓶，作为平行试验；空白组处理同上。按照1.4.3.2的方法分别进行蛋白含量的测定。

1.4.5 磁场处理时间对花粉蛋白含量的影响

在超净工作台上取灭菌花粉分别放入12个锥形瓶中，每瓶20 g，依次加入OD值为1.0的菌液2.5 mL，加入葡萄糖含量为30%，无菌水5 mL，搅匀。接种完成后，分别在磁场强度为4 mT下处理1，2，3，4，5 h。在35.0 ℃条件下继续培养至8 d。每个条件处理2瓶，作为平行试验；空白组处理同上。按照1.4.3.2的方法进行蛋白含量的测定。

1.4.6 磁场强度对花粉提取液蛋白含量的影响

在超净工作台上取灭菌花粉分别放入12个锥形瓶中，每瓶20 g，依次加入OD值为1.0的菌液2.5 mL，加入葡萄糖含量为30%，无菌水5 mL，搅匀。接种完成后分别在1，2，3，4，5 mT的磁场强度下处理4 h。在35.0 ℃条件下继续培养至8 d。每个条件处理2瓶，作为平行试验；空白组处理同上。按照1.4.3.2的方法进行蛋白含量的测定。

1.4.7 响应面法试验设计

在单因素试验的基础上，根据响应面试验设计原理，选取3个对花粉蛋白生成影响较大的因素，选择 Box-Behnken进行三因素三水平试验设计，见表1。

1.5 数据分析

单因素試验结果用Origin 2018进行分析，利用Design-Expert 10软件对工艺参数的组合进行优化，确定油菜蜂花粉固态发酵的最优条件。利用响应面分析法（RSM）得到回归模型和工艺参数。试验数据均采用平行试验的平均值，使用SPSS软件对所得数据进行组与组之间的方差分析，在置信区间（95%）内分析各组之间是否显著，用相同或不同字母表示不显著或显著。

2 结果与分析

2.1 发酵温度对花粉提取液中蛋白含量的影响

发酵温度是发酵过程中植物乳杆菌参与反应的重要因素之一，发酵温度对植物乳杆菌发酵过程中产生的黄酮有一定影响。发酵温度与花粉提取液蛋白含量的关系见图1。

由图1可知，当发酵温度从31 ℃升至35 ℃时，蛋白含量明显上升。当发酵温度从35 ℃升至39 ℃时，蛋白含量显著下降。原因是发酵温度影响了菌种的活性，进而影响发酵的质量，也可能是一些热敏蛋白发生变性导致蛋白含量降低。当发酵温度为35 ℃时花粉提取液中的蛋白含量最高，且与其他4组试验在95%的置信区间内有显著性差异。综上所述，初步确定35 ℃为合适的发酵温度。

2.2 菌液浓度对花粉提取液中蛋白含量的影响

发酵液中植物乳酸菌的浓度会影响花粉发酵的结果，当菌液浓度过低时，花粉发酵周期长，花粉营养物质释放不完全。当菌液浓度过高时，又会使菌体自身过多地消耗花粉的营养物质，造成发酵后一些营养指标偏低。菌液浓度与花粉提取液蛋白含量的关系见图2。

由图2可知，当菌液的OD值为0.7～1.0时，蛋白含量随着菌液浓度的升高呈上升趋势，菌液的OD值为1.0～1.6时，蛋白含量下降趋势明显，但菌液的OD值在1.6～1.9时蛋白含量又上升，原因可能是菌液过浓，菌体自身溶解释放了部分蛋白。当菌液的OD值为1.0时花粉提取液中的蛋白含量最高，且与其他组在95%的置信区间内均有显著性差异。因此，初步确定最佳的菌液OD值为1.0。

2.3 磁场处理时间对花粉提取液中蛋白含量的影响

交变磁场在一定条件下对微生物生长起到促进作用，但如果处理时间过长，可能有抑制或杀灭作用。磁场处理时间与花粉提取液蛋白含量的关系见图3。

由图3可知，随着处理时间的延长，蛋白含量呈上升趋势，在4 h之后先上升后下降，下降不显著；当磁场处理时间为4 h时花粉提取液中的蛋白含量达到最高，并且与其他4组试验在95%的置信区间内有显著性差异。随着时间的延长，蛋白含量降低，磁场处理时间延长与蛋白含量下降之间的具体作用机理尚不清楚。比较广泛研究的理论是长时间的磁场处理改变了细胞膜、某些分子（生物大分子等）和自由基的理化性质，对细胞造成损害[18-19]。还有一种原因可能是发酵环境中的极性大分子在交变磁场长时间的作用下发生机械旋转，内能增加，致使发酵温度上升（与微波加热原理相似），热效应导致微生物活性降低进而影响发酵质量。综上所述，初步确定合适的磁场处理时间为4 h。

2.4 磁场强度对花粉提取液中蛋白含量的影响

磁场强度的强弱对微生物活性的影响具有两面性，适当的磁场强度通过影响酶的活性进而可以促进微生物的生长和代谢产物的生成；反之则不利于微生物的生长繁殖。磁场强度与花粉提取液蛋白含量的关系见图4。

由图4可知，蛋白含量随着磁场强度的增强呈现先上升后下降的趋势，当磁场强度为3 mT时花粉提取液中的蛋白含量最高，且与其他试验组在95%的置信区间内差异显著。3 mT之后蛋白含量随着磁场强度的增强而减小。作用机理尚不清楚，基于细胞膜信号转导的磁场作用机制，磁场强度的大小能够通过调整细胞内钙离子浓度，导致信号转导受到干扰[20]，通过影响微生物细胞的活性，进而影响微生物发酵蜂花粉的质量。综合考虑，初步确定合适的交变磁场处理强度为3 mT。

2.5 响应面结果分析

2.5.1 响应面试验结果分析

在单因素试验的基础上，通过Design-Expert 8.0.6的Box-Behnken设计原理，对蜂花粉固态发酵的条件进行了三因素三水平试验，由响应面分析得到17组试验条件，每组做2次平行试验，结果取平均值，试验结果见表2。

根据Design-Expert 8.0.6软件对表2中数据进行回归拟合，得到蛋白含量（Y）对自变量菌液OD值（A）、磁场强度（B）和磁场处理时间（C）的多元回归方程：Y=9.24+0.024A+0.54B+0.63C+5.000E－003AB+0.058AC+0.080BC－0.19A2－0.47B2－0.61C2。

由表3可知，模型的F值为415.46，P值小于0.000 1，说明此模型的回归方程极显著。失拟项的P=0.085>0.05，说明失拟项不显著，该模型的模拟性较好，模型选择合理。模型中变量B、C、A2、B2和C2对蛋白含量的影响均极显著（P<0.000 1），说明试验影响因素与响应值不是一般的线性关系，一次项、二次项及B和C的交互作用对响应值均有很大的影响。模型中的复相关系数R2=0.998 1，修正复相关系数RAdj2=0.995 7，预测复相关系数RPred2=0.976 1，修正复相关系数与预测复相关系数差值小于0.2，说明二者有很好的相符度。信噪比为64.34＞4，说明本模型的试验结果可靠。由表3可知，对花粉提取液中蛋白含量的影响因素主次顺序为：C（磁场处理时间）＞B（磁场强度）＞A（菌液OD值）。综上所述，回归方程为蛋白含量提供了一个合适的回归模型。

2.5.2 验证试验

利用Design-Expert软件求解该模型，得出最佳菌液的OD值为1.0，磁场强度为3.31 mT，磁场处理时间为4.28 h。为验证结果的可靠性，采用上述优化参数再次进行蜂花粉固态发酵，为满足实际操作，将菌液OD值调整为1.0，磁場强度调整为3.3 mT，磁场处理时间调整为4.28 h。在此发酵条件下花粉提取液蛋白含量理论值为9.583 mg/g。对此发酵工艺条件重复2次进行验证试验，最终花粉提取液蛋白含量为9.534 mg/g，实际测定值与预测值相差较小，说明响应面优化得到的参数可靠。

2.5.3 发酵前后蛋白含量的变化

空白组用MRS液体培养基代替菌悬浊液，其他条件与试验组一致。得到空白组花粉提取液中蛋白含量的平均值为6.614 mg/g，响应面优化条件下花粉提取液中蛋白含量的实际值为9.534 mg/g，较空白组提升了44.1%，这也说明了磁场辅助发酵是可行的，是一种具有开发潜力的发酵方式。

3 结论

本试验采用弱交变磁场辅助优化蜂花粉固态发酵，有利于细胞内蛋白物质溶出，提高了花粉提取液中蛋白的含量。通过单因素试验和响应面分析法，最终确定最优条件组合为菌液发酵温度35 ℃、菌液OD值1.0、磁场处理时间4.28 h、磁场强度3.3 mT。在此条件下，发酵后花粉提取液中的蛋白含量9.534 mg/g较空白组的6.614 mg/g提高了44.1%，通过研究可知，交变磁场在辅助油菜蜂花粉固态发酵方面有一定的优势，该结果为交变磁场辅助微生物发酵提供了一定的参考，为蜂花粉固态发酵产品提供了一定的理论基础。

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