榛蘑蛋白提取工艺的优化研究

张倩 张文博 陈滢竹 姜旭 汤璐 王刚 李艳丽

摘要：蛋白质是一种保证机体健康的营养物质，具有多种功效。以榛蘑粉末为原料，榛蘑蛋白提取率为指标，采用碱提和超声分步提取榛蘑蛋白，利用响应面法优化榛蘑蛋白提取工艺，等电点法和盐析法相结合沉淀榛蘑蛋白。结果表明，液料比47∶1、碱提pH 10.0、碱提时间1.55 h、碱提温度80 ℃、超声功率200 W、超声pH 9.0、超声温度30 ℃的条件下，榛蘑蛋白的提取率为（76.59±0.23）%。榛蘑蛋白质沉淀的方法为先进行等电点沉淀（pI=3.7），然后用90%的饱和硫酸铵进行盐析。试验表明碱提和超声分步提取的方法与传统碱提法相比，可有效提高蛋白提取率。等电点法结合盐析法可提高蛋白得率。该试验结果为榛蘑蛋白的开发利用奠定了基础。

关键词：榛蘑；蛋白提取；响应面法；等电点法；盐析法

中图分类号：TS201.21      文献标志码：A     文章编号：1000-9973（2023）05-0118-07

Abstract： Protein is a nutrient that keeps the body healthy and has various functions. Using Armillaria mellea powder as the raw material and Armillaria mellea protein extraction rate as the index， Armillaria mellea protein is extracted by alkaline extraction and ultrasonic stepwise extraction， Armillaria mellea protein extraction process is optimized by response surface method， and Armillaria mellea protein is precipitated by the combination of isoelectric point method and salting out method. The results show that under the conditions of liquid-solid ratio 47∶1， alkaline extraction pH 10.0， alkaline extraction time 1.55 h， alkaline extraction temperature 80 ℃， ultrasonic power 200 W， ultrasonic pH 9.0 and ultrasonic temperature 30 ℃， the extraction rate of Armillaria mellea protein is （76.59±0.23）%. The precipitation method of Armillaria mellea protein is isoelectric point precipitation （pI=3.7） firstly， and then salting out with 90% saturated ammonium sulfate. The results show that compared with the traditional alkaline extraction method， the method of alkaline extraction and ultrasonic stepwise extraction could effectively improve the extraction rate of protein. Isoelectric point method combined with salting out method can improve the protein yield. The results have laid a foundation for the development and utilization of protein from Armillaria mellea.

Key words： Armillaria mellea; protein extraction; response surface methodology; isoelectric point method; salting out method

收稿日期：2022-11-09

基金项目：吉林省科技厅项目（20200404052YY）；2021省級大学生创新创业训练计划项目（202101108SJ）

作者简介：张倩（1998－），女，硕士研究生，研究方向：功能性食品。

*通信作者：李艳丽（1978-），女，硕士生导师，博士，研究方向：功能性食品。

蛋白质是一种优质的营养物质，缺乏蛋白质将会对人体健康造成影响[1]。现今，根据联合国最新一轮全球人口估计和预测，2080年世界人口将达到峰值104亿左右。随着人口数量的增长，对蛋白质的需求量也相应地大幅增长，许多发展中国家面临蛋白紧缺的问题，所以蛋白的制备受到广泛关注[2-3]。

在蛋白提取的研究中，传统的方法一般采用碱提法[4]，但研究发现加入一些其他的辅助方法可以增加蛋白的提取率，比如超声波辅助法，它可穿透细胞壁，使蛋白质溶出[5-6]。并且超声波辅助法操作简便，因此已在蛋白提取领域中被广泛应用[7-9]。

榛蘑又称蜜环菌，与天麻共生，为长白山特色食用菌之一，目前尚无法进行人工栽培。研究表明，榛蘑中包含萜类、多糖和蛋白质等多种物质，具有抗高血压、降血糖、抗氧化等药理作用[10]。Lin等以小鼠为模型研究发现了其水提取物对抑郁行为有抑制作用[11]。Wu等[12]发现从蜜环菌中得到的水溶性多糖可以有效地抑制肿瘤生长，具有非常高的开发价值[13-14]。此外，榛蘑富含蛋白质，且含有人体全部必需氨基酸，极具营养价值，是一种非常优质的蛋白质资源。但是，目前其蛋白质的提取工艺尚未见报道。

本研究以榛蘑蛋白为研究对象，采用碱提和超声分步提取榛蘑蛋白，等电点法和盐析法沉淀榛蘑蛋白，目的是提高榛蘑蛋白的提取率，为榛蘑蛋白的开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

新鲜榛蘑：购自延吉市绿之源松茸特产品经营部。

1.2 主要试剂

BCA试剂盒：索莱宝科技有限公司；氢氧化钠、盐酸、硫酸、硫酸铜、硫酸钾、硼酸：北京化工厂。

1.3 仪器与设备

SIN415-2903酶标仪 Omega公司；DK-8D电热恒温水槽 上海精宏实验设备有限公司；TG2-16B离心机 上海安亭科学仪器厂；Alpha 2-4LD Plus冻干机 Marin Christ公司；PHSJ-3F pH计 上海仪电科学仪器有限公司；KQ5200DB数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；JA1003分析天平 上海良平仪器仪表有限公司；Kjeltec-8400全自动凯氏定氮仪 丹麦福斯分析仪器有限公司；GX-04粉碎机 浙江省永康市昌发工具厂；GZX-9240MBE电热鼓风干燥箱 上海博迅实业有限公司；GHP-9080恒温培养箱 常州隆和仪器制造有限公司。

1.4 试验方法

1.4.1 材料预处理

将新鲜的榛蘑洗净，晾干，磨碎后过80目筛，得到榛蘑粉，于4 ℃备用。

1.4.2 榛蘑蛋白含量的测定方法

榛蘑干粉中总蛋白含量采用凯氏定氮法测定[15]。

标准曲线的绘制：以牛血清白蛋白BSA为标准品，按照BCA试剂盒说明书方法操作，使用酶标仪测定在562 nm处的吸光值，绘制蛋白标准曲线。

采用BCA试剂盒法测定提取液中蛋白质含量，通过标准曲线查得蛋白质浓度。

1.4.3 蛋白提取率的计算公式

蛋白提取率计算公式如下：

蛋白提取率（%）=上清液中蛋白浓度×上清液体积原料质量×原料中蛋白质含量×100%。

1.4.4 碱提和超声分步提取榛蘑蛋白的工艺流程

首先进行碱法提取榛蘑蛋白，即称取榛蘑干粉，按1∶47的比例加入蒸馏水，用0.1 mol/L的NaOH溶液调节pH为10.0，于80 ℃恒温水浴锅中反应，1.55 h后以10 000 r/min離心20 min，收集上清液。然后进行超声提取，即向碱提后的残渣中加入与碱提相同比例的蒸馏水，用0.1 mol/L的NaOH溶液调pH为9.0，在超声温度为30 ℃、功率为200 W的条件下超声反应15 min。反应结束后，以10 000 r/min离心20 min，收集上清液。将两次离心后的上清液合并，用0.1 mol/L的HCl调节pH为3.7，4 ℃静置12 h，以10 000 r/min离心20 min。收集沉淀，向上清液中加入90%的饱和硫酸铵，4 ℃静置12 h，以10 000 r/min离心20 min。收集沉淀，将两次离心后的沉淀用PBS缓冲液溶解，得榛蘑蛋白质溶液。

1.4.4.1 碱提法提取榛蘑蛋白的单因素试验

按照1.4.4中的方法，以蛋白提取率为指标，考察碱提各因素对蛋白提取的影响。

pH的影响：温度70 ℃，时间1 h，液料比35∶1，调节pH为7.0，8.0，9.0，10.0。

液料比的影响：温度70 ℃，时间1 h，pH 10.0，调节液料比为20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1、45∶1、50∶1。

碱提温度的影响：时间1 h，pH 10.0，液料比45∶1，调节温度为60，70，80，90 ℃。

碱提时间的影响：温度80 ℃，pH 10.0，液料比45∶1，调节时间为0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 h。

1.4.4.2 超声提取榛蘑蛋白的单因素试验

按照1.4.4中的方法，在碱提基础上进行超声提取。以蛋白提取率为指标，考察超声各因素对蛋白提取率的影响。

超声时间的影响：温度30 ℃，超声功率200 W，pH 9.0，调节时间为5，10，15，20 min。

超声pH的影响：超声时间15 min，温度30 ℃，超声功率200 W，调节pH为7.0，8.0，9.0，10.0。

1.4.4.3 碱提和超声分步提取榛蘑蛋白的响应面优化试验

按照1.4.4中的方法，根据单因素试验结果，选取液料比（A）、碱提时间（B）、超声pH（C）为影响因子，蛋白提取率为响应值（Y），对碱提和超声分步提取榛蘑蛋白条件进行响应面优化试验设计，见表1。

1.4.4.4 榛蘑蛋白等电点的确定

将碱提和超声分步提取的榛蘑蛋白上清液用0.1 mol/mL的HCl调节pH分别为 3.1，3.3，3.5，3.7，3.9，4.1，4.3，4.5，4 ℃静置12 h，以10 000 r/min离心20 min。采用考马斯亮蓝法测定沉淀中蛋白含量，确定榛蘑蛋白的等电点。

1.4.4.5 榛蘑蛋白盐析饱和硫酸铵的浓度的确定

取等电点法沉淀后的上清液加入饱和硫酸铵溶液。4 ℃静置12 h，以10 000 r/min离心20 min。采用考马斯亮蓝法测定沉淀中蛋白含量，确定所需饱和硫酸铵的浓度。

2 结果与分析

2.1 榛蘑蛋白粉总蛋白含量

利用凯氏定氮法测得榛蘑干粉中蛋白含量为20%。

2.2 碱提榛蘑蛋白的单因素试验结果

2.2.1 碱提pH的影响

由图1可知，随着pH的增大，榛蘑蛋白提取率逐渐上升。碱浓度的升高会加大榛蘑细胞壁的破裂，使榛蘑蛋白溶出，提高榛蘑蛋白的提取率。当碱提pH值在9.0～10.0之间时，蛋白提取率上升趋势缓慢。因此，将碱提pH值确定为10.0。

2.2.2 液料比的影响

由图2可知，随着液料比的增大，榛蘑蛋白提取率呈逐渐上升趋势。在液料比达到45∶1时，榛蘑蛋白提取率不再上升，这可能是因为在液料比达到45∶1之前，随着液体体积的增加，液体和固体之间的接触面积增大，从而榛蘑蛋白提取率增加。因此，最适液料比为45∶1。

2.2.3 碱提温度的影响

由图3可知，随着碱提温度的升高，榛蘑蛋白提取率先上升后下降。在碱提温度达到80 ℃时，榛蘑蛋白提取率达到最高值，这可能是因为温度的升高促进了对榛蘑细胞壁的破坏，从而提高了榛蘑蛋白的提取率，在80 ℃时达到峰值。继续升高碱提温度，蛋白提取率呈现下降的趋势，这可能是因为过高的温度使已经提取出的榛蘑蛋白变性[16]，从而使蛋白提取率下降。因此，最适碱提温度为80 ℃。

2.2.4 碱提时间的影响

由图4可知，随着碱提时间的不断增加，榛蘑蛋白提取率呈现先上升后下降的趋势。在时间为1.5 h时，榛蘑蛋白提取率达到最大，后续随着时间的增加，蛋白提取率呈现下降的趋势，原因可能是在80 ℃处理下，碱提时间的增加会破坏榛蘑蛋白，从而导致蛋白提取率下降。因此，最适碱提时间为1.5 h。

2.3 超声提取榛蘑蛋白的单因素试验结果

2.3.1 超声时间的影响

由图5可知，随着超声时间的增加，榛蘑蛋白提取率先上升后下降。在超声时间达到15 min时，榛蘑蛋白提取率达到最高，后续随着超声时间的增加，蛋白提取率逐渐下降，造成这种情况的原因是超声波可以破碎细胞壁[17]，使蛋白提取率增大，之后随着超声时间的增加，超声波会破坏溶解出的蛋白，使榛蘑蛋白提取率下降。因此，最适超声时间为15 min。

2.3.2 超声pH的影响

由图6可知，随着pH的逐渐增大，榛蘑蛋白提取率呈现逐渐上升的趋势。这是因为pH的升高会加大榛蘑细胞壁的破裂，使榛蘑蛋白溶出，提高榛蘑蛋白的提取率。当超声pH值达到9.0时，蛋白提取率达到最大，之后pH增大对已溶出的蛋白造成了破坏，使蛋白提取率下降。因此，提取榛蘑蛋白的最适超声pH为9.0。

2.4 不同蛋白提取方法的比较

比较了单独碱提法、单独超声法（提取条件同碱提和超声分步提取法中的超聲提取法）、碱提和超声分步法、超声和碱提分步法（超声条件同单独超声法，碱提条件同单独碱提法）4种方法对榛蘑蛋白的提取率，结果见图7。

由图7可知，单独超声法蛋白提取率最低，为23.33%，单独碱提法提取率次之，为43.28%，先超声后碱提法提取率第三，为66.72%，先碱提后超声法提取率最高，为74.70%。因此，本试验确定的碱提和超声分步提取法提取榛蘑蛋白获得了最佳的提取率。

2.5 碱提和超声分步提取榛蘑蛋白的响应面优化结果

2.5.1 响应面优化试验方案及结果

对榛蘑蛋白进行碱提和超声分步提取，响应面优化试验方案及结果见表2。

采用Design-Expert 8.0.6软件对表2中的数据执行二次多项式的逐步回归拟合。最终的数学模型为Y=77.58－0.35A+0.68B+0.042C－0.6AB+0.2AC－0.28BC－1.76A2－1.55B2－1.74C2。回归模型方差分析结果见表3。

由表3可知，模型的F值为139.81，P值<0.05，差异显著，其中A、B、AB、BC、A2、B2、C2的P值均小于0.05，说明一次项A、B，交互项AB、BC，二次项A2、B2、C2对榛蘑蛋白的提取率均具有显著影响。失拟项的P值为0.317 8>0.05，表现为不显著，说明拟合效果较好，并且R2=0.994 5>0.9，所以模型的结果符合实际，可以用来对榛蘑蛋白提取率进行预测和优化。

2.5.2 响应面各因素交互作用分析

响应面可以直观地体现各个参数之间的相互作用[18]。3D曲面图表面越平缓，表明此因子对结果的影响越小；表面越陡峭，表明此因子对结果的影响越大。等高线图形状越接近椭圆，则相关性越大；而越接近法线圆，则相关性越小[19]。

2.5.2.1 液料比与碱提时间的交互作用

由图8可知，等高线图呈现椭圆形，说明液料比和碱提时间之间的相关性很大。固定碱提时间不变，增大液料比时，蛋白提取率先上升后下降；固定液料比不变，增加碱提时间时，蛋白提取率先上升后下降。

2.5.2.2 液料比与超声pH的交互作用

由图9可知，等高线图呈现椭圆形，说明液料比和超声pH之间的相关性很大。固定液料比不变，增大超声pH时，蛋白提取率先上升后下降；固定超声pH不变，增大液料比时，蛋白提取率先上升后下降。

2.5.2.3 碱提时间与超声pH的交互作用

由图10可知，等高线图呈现椭圆形，说明碱提时间和超声pH之间的相关性很大。固定碱提时间不变，增加超声pH时，蛋白提取率先上升后下降；固定超声pH不变，增加碱提时间时，蛋白提取率先上升后下降。

2.5.3 响应面因素水平优化结果及模型验证

通过Design-Expert 8.0.6软件分析响应面试验的结果，预测提取榛蘑蛋白的最佳参数为液料比47.78∶1、碱提pH 10.0、碱提时间1.55 h、碱提温度80 ℃、超声功率200 W、超声pH 9.04、超声温度30 ℃，此条件下的蛋白提取率为76.86%。根据试验的可行性，将条件调整为液料比47∶1、碱提pH 10.0、碱提时间1.55 h、碱提温度80 ℃、超声功率200 W、超声pH 9.0、超声温度30 ℃，得到蛋白提取率（76.59±0.23）%。蛋白提取率与预测值无明显差异，说明建立的模型与实际情况拟合良好。

2.6 榛蘑蛋白等电点的测定

由图11可知，当pH为3.7时，吸光度值最大，即蛋白含量最高，在此pH下，蛋白沉淀最多，所以确定pI=3.7为榛蘑蛋白的等电点。

2.7 盐析法沉淀蛋白硫酸铵浓度测定

由图12可知，当饱和硫酸铵浓度为90%时，吸光度值最大，此时蛋白沉淀也最多，所以盐析时选取的饱和硫酸铵浓度为90%。

2.8 不同蛋白沉淀方法的比较

分别采用单独等电点法、单独盐析法、盐析法和等电点法联用、先盐析后等电点法与先等电点后盐析法5种方法进行蛋白沉淀，结果见表4。

由表4可知，等电点法结合盐析法总体上高于单独等电点法和单独盐析法，其中，先等电点后盐析法所得蛋白最多，而单独等电点法所得蛋白最少。

3 讨论与结论

超声辅助碱提取蛋白法在目前食用菌蛋白提取中已有报道。姜伊悦等[20]研究表明，超声辅助碱提法有利于元蘑蛋白的提取，弓志青等[21]采用超声辅助碱提法提取了香菇柄蛋白。因此，先超声后碱提法的结合可以更有效地提取食用菌蛋白。本试验结果表明，先超声后碱提法所得榛蘑蛋白的提取率为66.72%，高于单独碱提法的43.28%和单独超声法的23.33%。为进一步提高提取率，进行了先碱提后超声法的实践，并进行响应面优化试验。响应面分析法是一种统计方法，能够分析多种变量之间交互影响问题[22]。结果表明，先碱提后超声相结合与单独碱提法相比，蛋白提取率提高了76.96%。说明两种方法之间有促进作用，进而使蛋白提取率有所提高。

传统的蛋白沉淀方法多为等电点法[23]或盐析法[24]。本试验将二者结合，结果表明，比单独等电点和盐析所得蛋白含量有明显提高。其中，先等电点后盐析所得蛋白的含量比单独等电点法提高1.81倍。

通过单因素试验及响应面优化法对超声和碱提分步提取榛蘑蛋白工艺进行了优化研究，得到榛蘑蛋白的最佳提取工艺为液料比47∶1、碱提pH 10.0、碱提时间1.55 h、碱提温度80 ℃、超声功率200 W、超声pH 9.0、超声温度30 ℃，此条件下蛋白的提取率为（76.59±0.23）%。榛蘑蛋白质沉淀的方法为先进行等电点沉淀（pI=3.7），然后用90%的饱和硫酸铵进行盐析。本研究结果为榛蘑蛋白的开发利用提供了基础。

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