运输时间对高体鰤幼鱼应激、代谢、抗氧化和免疫的影响

王文雯,杨静茹,付正祎,于刚,马振华,4*

(1.三亚热带水产研究院,海南 三亚 572018;2.中国水产科学研究院南海水产研究所,广东 广州 510300;3.大连海洋大学水产与生命学院,辽宁 大连,116000; 4.农业农村部外海渔业可持续利用重点实验室,广东 广州 510300)

活鱼运输是鱼类生产过程中的重要环节,通常鱼类的生存环境突然改变会对鱼体的生理机能产生影响[1]。氧气袋充氧运输具有体积小、用水量少、成活率高等优点, 广泛用于水产苗种运输, 而运输时间长会导致氧气袋内水质恶化,氨氮浓度升高[2]。相比于正常情况,鱼类在发生应激反应时,体内激素分泌和物质能量代谢等生理变化和生化反应的过程会发生显著的变化,使其免疫功能下降,影响鱼体的健康甚至威胁生命。在鱼类运输过程中,导致其产生应激反应的原因有很多,例如氨氮胁迫、温度胁迫及酸碱度因子改变等[3]。

高体鰤(Serioladumerili),又名杜氏鰤、紫鰤,属硬骨鱼纲(Osteichthyes)、鲈形目(Perciformes)、鲹科(Carangidae)、鰤属(Seriola)。体长圆形,吻大于眼径,为暖水性中上层鱼类,较适宜高体鰤生长的pH为7.8～8.4。生存水温为9.0～33.0 ℃,适宜水温为20～30.0 ℃。摄食的水温范围14.0～30.0 ℃[4],且具有生长速度快、养殖周期短的特点。

目前,随着高体鰤养殖业不断发展,对其鱼苗的需求量也日渐增多,鱼苗运输频繁,因此探究运输时间对高体鰤幼鱼应激、代谢、抗氧化及免疫所产生的影响,保证运输过程中鱼苗质量显得非常重要。目前关于高体鰤幼鱼运输时间的研究报道较少,本实验采用塑料袋密闭降温充氧模拟运输,主要目的是为了进一步了解其在运输时间的胁迫下,对高体鰤幼鱼应激、代谢、抗氧化和免疫的影响。量化了高体鰤幼鱼在运输过程中的应激程度,总结了最优的高体鰤幼鱼运输密度和运输时长,以便提供更科学的运输方法,减少运输过程中对高体鰤幼鱼的伤害。

1 材料和方法

1.1 主要仪器与材料

本研究所用高体鰤幼鱼[体重(19.00±3.00) g,体长(10.34±1.33) cm]采集自中国水产科学研究院南海水产研究所热带水产研究开发中心陵水试验基地,实验前转至室内循环水产养殖系统中暂养一周,水的温度、盐度以及pH值分别为25.40 ℃、4.80和7.26。

本研究所用试剂主要包括:总RNA提取试剂Trizol(中国白鲨)、50×TAE电泳缓冲液(中国南京建成生物工程研究所)、核酸染料(上海生工生物工程股份有限公司)、EasyScript®All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix(北京金式金生物技术有限公司)、SYBR Green RealUniversal彩色荧光定量试剂盒(北京天根生化科技有限公司)。丙二醛(中国南京建成生物工程研究所)、糖原(中国南京建成生物工程研究所)。

本研究所用仪器设备主要包括:匀浆机(杭州奥盛仪器有限公司,Bioprep-24)、冷冻离心机(德国Biofuge公司, D-37520)、电泳仪(北京六一生物科技有限公司,DYY-6C)、微紫外分光光度计(中国北京百泰克生物技术有限公司,ND5000),PCR热循环仪(中国杭州晶格科学仪器有限公司,T960)、荧光定量PCR仪(Analytik Jena仪器公司,qTower3)、凝胶成像系统(杭州朗基科学仪器有限公司,LG2020)

1.2 模拟运输实验方法

实验前先将高体鰤幼鱼禁食24 h。设置3组运输时间分别为4、8和12 h,在运输时间不同的3个组中,每组设置3个平行,每袋放入大小相似的高体鰤幼鱼5尾,共45尾。每个实验组注入海水4 L,并把袋子内空气排空,充入纯氧。充氧完毕后快速使用橡皮筋封口,置于温度为25.40 ℃的泡沫箱中。模拟运输实验期间禁止打开塑料袋,同时在24.70 kg/m3运输密度下进行运输[5-7]。每隔1 h摇动一次箱子,每次晃动5下,用于模拟运输中的震动[8]。

1.3 采集和分析

运输后,记录各组水的温度、pH和溶解氧(Dissolved oxygen,DO)。每袋取500 mL水样,使用多参数水质仪测定氨氮浓度。从每个袋子随机取出3条鱼,用1 mL注射器从静脉采血,3 500g离心10 min,收集血清并在-80 ℃下储存,直至分析。在分析中,每组3个重复,取适量的整鱼组织,置于2 mL离心管中,以1∶9(v/v)的比例加入0.86%生理盐水溶液,并用匀浆机匀浆。匀浆在3 500g下离心10 min,收集上清液并于-80 ℃保存待酶活性分析。

1.3.1 总RNA的提取和cDNA的合成

高体鰤幼鱼鳃和肝脏研磨后,使用总RNA提取剂Trizol提取组织总RNA。通过琼脂糖凝胶进行电泳测试RNA。当OD260/280在1.8～2.0范围内时,认为该方法有效。根据反转录试剂盒EasyScript®All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix说明书进行反转录[9],合成模板cDNA。

1.3.2 免疫基因荧光定量分析

实时定量PCR分析由PCR系统运行。热循环程序如下:①预变性:95 ℃初始变性15 min;②扩增反应:95 ℃变性10 s,循环40次,56 ℃退火20 s,72 ℃延伸30 s;③熔解曲线分析为单峰,确定在每个PCR反应结束时不存在非特异性产物。每个样品反应体系为20 μL,其中包含:10 μL 2×RealUniversal,上、下游引物各0.6 μL(10 μmol/L),2 μL模板cDNA和6.8 μL RNase-free ddH2O。将cDNA模板进行10倍稀释后建立标准曲线,引物扩增效率在90%～110%。β-actin作内参基因,根据2-ΔΔCt计算法进行相对荧光值计算。具体引物见表1。

表1 免疫相关引物序列

1.3.3 成活率计算公式

成活率(%)=100×(Nt/N0)

式(1)

公式中:Nt代表实验结束时鱼的尾数,N0代表实验开始时鱼的尾数。

1.3.4 统计分析

采用Origin 2021作图,SPSS 26.0统计软件对结果进行分析。所有数据均以标准差(平均值±标准差)表示。组间比较采用单因素方差分析和LSD检验。P<0.05认为具有显著性差异。

2 结果与分析

2.1 不同运输时间水质和高体鰤幼鱼成活率变化分析

不同运输时间下水体温度、pH、溶解氧、氨氮值和高体鰤幼鱼成活率如表2所示:在3个时间组中,运输12 h时的水温显著升高(P<0.05)。pH随运输时间增长显著降低(P<0.05),12 h组中pH最低。溶解氧在4 h组和8 h组中差异不显著,但随着时间增加,在达到12 h时溶解氧最低,显著低于4 h和8 h(P<0.05)。氨氮浓度随时间增长逐渐升高,但在8 h和12 h组中差异不显著。随着运输时间的增加对高体鰤幼鱼的成活率没有显著影响。

表2 不同运输时长水质指标和高体鰤幼鱼成活率变化分析

2.2 不同运输时间高体鰤幼鱼应激指标变化分析

2.2.1 不同运输时间高体鰤幼鱼肝应激的影响

高体鰤幼鱼经过密闭充氧运输不同时间后,热休克蛋白70(HSP70)、热休克蛋白90(HSP90)和糖皮质激素受体(GR)在肝脏中的表达水平如图1所示,图1(a)中HSP70在运输8 h的表达水平显著高于4 h和12 h,具有显著性差异(P<0.05)。图1(b)中HSP90在运输4 h的表达水平显著高于8 h、12 h,存在显著性差异(P<0.05)。图1(c)中GR在运输4 h时的表达水平显著低于8 h和12 h(P<0.05)。

图1 不同运输时间对高体鰤幼鱼肝脏应激的影响

2.2.2 不同运输时间高体鰤幼鱼鳃应激指标的变化

高体鰤幼鱼经过密闭充氧运输不同时间后, HSP70、HSP90和GR在鳃中的表达水平如图2所示,在图2(a)中,HSP70在运输8 h时的表达水平最高,显著高于4 h和12 h时的表达水平(P<0.05)。在图2(b)中,HSP90在三组间不具有显著性差异。在图2(c)中,GR表达水平在三组间不具有显著性差异。

图2 不同运输时间对高体鰤幼鱼鳃应激的影响

2.3 不同运输时间高体鰤幼鱼代谢指标变化分析

2.3.1 不同运输时间高体鰤幼鱼肝代谢指标的变化

经过密闭充氧运输不同时间后,丙酮酸激酶(PK)、肉碱棕榈酰转移酶(CPT-1)、糖原(GLY)和葡萄糖激酶(GK)在肝脏中的表达水平如图3所示,8 h组PK的表达水平显著低于4 h和12 h,并与4 h和12 h存在显著性差异(P<0.05),4 h和12 h无显著性差异;而在CPT-1表达水平可以看出,12 h时的CPT-1表达水平显著高于4 h和8 h,并存在显著性差异(P<0.05),但4 h和8 h的CPT-1表达水平无显著性差异。从GLY表达水平中可以看出,4 h的GLY浓度显著高于8 h和12 h,12 h的GLY浓度显著高于8 h的GLY浓度,三组间均存在显著性差异(P<0.05)。GK表达水平在12 h时显著高于4 h和8 h,且三组间均具有显著性差异(P<0.05)。

图3 不同运输时间高体鰤幼鱼肝脏代谢的影响

2.3.2 不同运输时间高体鰤幼鱼鳃代谢指标的变化

经过密闭充氧运输不同时间后, PK、CPT-1和GK在鳃中的表达水平如图4所示,从图4(a)可分析出8 h组的PK表达水平显著高于4 h和12 h(P<0.05),4 h和12 h无显著性差异;在图4(b)中,8 h组的CPT-1表达水平显著高于4 h和12 h(P<0.05),而4 h和12 h的CPT-1表达水平无显著性差异;在图4(c)中可以看出8 h组GK的表达水平显著高于4 h和12 h,具有显著性差异(P<0.05),而4 h和12 h的GK表达水平相比差异不显著。

图4 不同运输时间高体鰤幼鱼鳃代谢的影响

2.4 不同运输时间高体鰤幼鱼抗氧化指标变化分析

2.4.1 不同运输时间高体鰤幼鱼肝抗氧化的影响

经过密闭充氧不同时长运输实验后,铜超氧化物歧化酶(Cu-SOD)、锰超氧化物歧化酶(Mn-SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)和谷胱甘肽还原酶(GSR)在肝脏中的表达水平如图5所示:Cu-SOD、Mn-SOD和CAT的表达水平在12 h均显著高于4 h和8 h(P<0.05),4 h和8 h均不具有显著性差异;在GSH-PX表达水平和GSR表达水平方面,12 h与4 h和8 h间均具有显著性差异(P<0.05),4 h与 8 h的GSH-PX表达水平和GSR表达水平均不具有显著性差异。图6是在不同运输时间对高体鰤幼鱼MDA浓度的影响,丙二醛(MDA)浓度在运输4 h时与8 h和12 h间无显著性差异,但12 h的MDA浓度显著高于8 h(P<0.05)。

图5 不同运输时间对高体鰤幼鱼肝脏抗氧化的影响

图6 不同运输时间对高体鰤幼鱼肝脏MDA浓度的影响

2.4.2 不同运输时间高体鰤幼鱼鳃抗氧化的影响

经过密闭充氧不同时间运输实验后,在鳃中的表达水平如图7所示,8 h的Cu-SOD的表达水平显著高于4 h和12 h(P<0.05);4 h的Mn-SOD与8 h时无显著性差异,4 h和8 h 时Mn-SOD的表达水平显著低于12 h,12 h组与其他两组具有显著性差异(P<0.05); CAT表达水平中,4 h与12 h不存在显著性差异,8 h显著高于4 h和12 h,具有显著性差异(P<0.05);在GSH-PX的表达水平和GSR的表达水平中可以看出,8 h与相邻组间均存在显著性差异(P<0.05);随着运输时间的增加,丙二醛(MDA)浓度也逐渐升高,12 h时高于4 h和8 h,三组间差异显著(P<0.05)。

图7 不同运输时间对高体鰤幼鱼鳃抗氧化的影响

2.5 不同运输时间高体鰤幼鱼免疫指标变化分析

2.5.1 不同运输时间高体鰤幼鱼肝免疫的影响

经过密闭充氧运输不同时长后,肝脏中免疫基因的表达水平如图8所示:在抗体方面,12 h的免疫球蛋白T(IGT)和主要组织相容性复合物(MHC-1)的表达水平显著高于4 h和8 h,三组具有显著性差异(P<0.05)。在细胞因子方面,肿瘤坏死因子(TNF-α)在12 h的表达水平显著高于4 h和8 h(P<0.05),8 h的表达水平显著低于4 h和12 h(P<0.05);在转录因子方面,三组间核因子KB(NF-KB1)的相对表达量无显著性差异。

图8 不同运输时间对高体鰤幼鱼肝免疫的影响

2.5.2 不同运输时间高体鰤幼鱼鳃免疫的影响

经过密闭充氧运输不同时长后,鳃中免疫基因的表达水平如图9所示:在抗体方面,12 h的MHC-1表达水平显著低于4 h和8 h,具有显著性差异(P<0.05),而4 h与8 h 的MHC-1表达水平无显著性差异。在转录因子方面,三组间8 h 的NF-KB1表达量显著高于相邻两组,且12 h同样显著高于4 h,三组间均具有显著性差异(P<0.05)。在细胞因子方面,干扰素(IFN-γ)4 h的表达水平显著高于8 h和12 h,与其他两组有显著性差异(P<0.05),8 h与12 h无显著性差异。

图9 不同运输时间对高体鰤幼鱼鳃免疫的影响

3 讨论

3.1 不同运输时间对水质的影响

氧气在鱼类保活运输过程中起着至关重要的作用。在运输过程中,塑料袋内含氧量过低会对活鱼造成低氧胁迫,发生氧化应激反应[3],对鱼体抗氧化、免疫等有着关键影响。运输水质会随着时间的增加而恶化,对鱼类的存活、保活时间、鱼苗体质健康等有着至关重要的影响[10-11]。研究表明,黑尾近红鲌(Ancherythroculternigrocauda)[5]和翘嘴鲌(Culteralburnus)[12]幼鱼在运输过程中,氨氮会随着时间的增加而升高,溶解氧和pH降低,与本研究结果一致。本研究在实验开始前水体清澈见底,随着运输时间的增加,高体鰤幼鱼自身呼吸代谢释放出过多二氧化碳,导致pH降低,氨氮浓度增加。在运输过程中,鱼体代谢产物及体表粘液是水体中氨氮的主要来源,而氨氮也是主要的环境胁迫因子,氨氮值因为水的pH、温度不同,分为离子氨和非离子氮,离子氨极易造成水体浑浊,阻碍鱼体正常摄入氧气;而非离子氮作为脂溶性物质,容易对鱼鳃造成伤害,使鱼体形成氨中毒,造成鱼体应激反应。过低的溶解氧含量同样会导致鱼体发生氧化应激反应,短时间缺氧在溶解氧浓度恢复后,鱼的肝脏损伤虽然略有恢复但无法恢复到初期[13-14]。

3.2 不同运输时间对高体鰤幼鱼应激的影响

运输应激是鱼类在运输过程中,由于禁食、振动的水体、温度和溶解氧等突然发生改变从而引起不同程度的氧化应激反应[15]。氧化应激发生时,可导致鱼体的脂类、蛋白质、碳水化合物和核酸的氧化损伤[16]。

热休克蛋白(Heat Shock Proteins, HSPS)是一个蛋白家族,其中包括热休克蛋白70(HSP70)和热休克蛋白90(HSP90)。HSP70能增强细胞对环境变化的耐受性,提高细胞存活率[17]。有研究表明,随着运输时间的增加,溶解氧逐渐降低,导致斑马鱼(Daniorerio)肝脏中的HSP70表达水平在其环境下显著升高,出现应激反应[18]。HSP90也是一种重要的应对氧气改变的应激蛋白,HSP90抗体与辅助分子共同调节ATP的水解过程,促使HSP90抗体分子伴侣开始循环,为该过程提供能量[19]。有研究表明虹鳟(Oncorhynchusmykiss)在受到环境胁迫时,肝脏中HSP70的表达水平显著上升[20]。在本研究中,运输8 h时高体鰤幼鱼的肝脏和鳃中HSP70的表达水平最高,表明由于运输时间的增加,此时高体鰤幼鱼肝脏和鳃受到运输环境胁迫使体内HSP70的表达水平升高,与虹鳟的研究结果相似。在田照辉等[21]的研究中发现,西伯利亚鲟(Acipenserbaerii)体内的HSP70基因在不同组织中,鳃最先表达。在本研究中,高体鰤幼鱼鳃中HSP70的表达水平高于肝脏内的表达水平,表明HSP70基因在鳃组织最先有较高的诱导表达,与西伯利亚鲟研究结果相似。HSP90对应激的适应也起到了重要作用,保护蛋白质不被降解,维持细胞生存[22]。在本研究中,高体鰤幼鱼肝脏内HSP90在运输4 h时表达水平最高,表明当受到胁迫时,肝脏细胞通过增加HSP90的表达来抵抗应激。在肝脏组织中,测定了GR的表达水平,GR有着极其重要的生理功能,其在肝脏内的表达水平最强,可减轻对细胞的损伤。有研究表明,糖皮质激素调控小鼠氧化应激反应[24]。GR的表达水平升高表示保护外来刺激对肝脏造成的伤害,从而减轻氧化应激,对鱼体呼吸起到一定的干预作用。在本研究中,运输时间越长,高体鰤幼鱼肝脏内GR的表达水平越高。

3.3 不同运输时间对高体鰤幼鱼代谢的影响

糖原(GLY)是获取能量的主要来源,对维持机体的能量代谢和重要功能物质的合成有着重要的作用[23]。有研究表明,当军曹鱼(Rachycentroncanadum)受到胁迫后,肝脏中糖原的含量会显著下降[25],说明鱼类在应激过程中通过改变自身代谢为机体提供能量。在本研究中,运输8 h 和12 h的高体鰤幼鱼中GLY浓度与4 h的浓度相比显著降低,说明在运输过程中,高体鰤幼鱼大量分解糖原,维持血糖浓度,随着时间增加通过各种生理生化调节逐渐适应,代谢趋于正常。丙酮酸激酶(PK)和肉碱棕榈酰转移酶(CPT-1)是调节新陈代谢的酶。有研究表明在草鱼(Ctenopharyngodonidella)中PK主要在肝脏中表达[26],本研究中高体鰤幼鱼在运输8 h时其PK在鳃中表达水平最高,在肝脏中的表达水平最低,可能是运输时间增加,肝功能代谢受损。CPT-1是脂肪酸氧化的限速酶,在机体或组织能量不足时,催化脂肪酸进入线粒体进行氧化,维持血糖和能量供应平衡。有研究表明大黄鱼(Larimichthyscrocea)CPT-1在肝脏中表达水平最高[27]。本研究中,高体鰤幼鱼CPT-1主要在肝脏中表达,与大黄鱼研究结果相似。在不同运输时间下,肝脏中CPT-1的表达水平在12 h时最高,表明12 h时幼鱼体内最需要血糖和能量平衡。GK是血糖调控核心器官细胞内葡萄糖代谢的一个关键酶,GK功能受损会导致整个机体调节系统失常,糖代谢紊乱[28]。在本研究中,高体鰤幼鱼肝脏内GK的表达水平随着运输时间的增加显著升高,表明此时GK抑制肝脏内糖原分解,在维持血糖稳态中发挥重要作用。

3.4 不同运输时间对高体鰤幼鱼抗氧化的影响

鱼体具有抗氧化防御系统,其主要由各种抗氧化物酶类及抗氧化物质谷胱甘肽组成,可维持鱼体内自由基平衡。若长时间运输,导致应激过强,鱼体组织因承受过大压力而受到严重损伤,则机体抗氧化水平随之降低,导致机体平衡被打破[10, 29]。鱼类在受到外界环境刺激时,抗氧化防御体系会起到重要的作用,清除过多的活性氧离子(ROS),其中超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)、谷胱甘肽(GSH)及丙二醛(MDA)等物质在免疫调节过程中也扮演着重要角色。在抗氧化酶方面,CAT、GSH-PX、Cu-SOD、Mn-SOD是重要的抗氧化酶,保护机体免受伤害。

有研究表明正常情况下机体不断生成自由基,由于SOD的存在,又不断的清除自由基,将其转化为H2O2和O2保护机体细胞内环境稳定[30],使SOD和自由基处于一种平衡的状态,具有抑制应激、减轻炎症的作用。体内SOD表达量越高,抗氧化能力越强[31]。在张美东等[32]的研究中发现,鲢(Hypophthalmichthysmolitrix)在受到胁迫时,其肝脏中Cu-SOD和Mn-SOD的表达水平显著上升。在本研究中,随着运输时间的增加,水中溶解氧浓度逐渐降低,高体鰤幼鱼体内Mn-SOD的表达水平随着运输时间的增加不断上升,与研究结果一致。说明运输时间越久,溶解氧越低,在受到低氧胁迫时,高体鰤幼鱼体内自由基水平上升,激活了体内的抗氧化体系,使体内过多的自由基被清除。过氧化氢酶(CAT)可以将SOD产生的H2O2转化为H2O,维持氧化还原反应的平衡。研究表明鲫(Carassiusauratus)受到胁迫时,会导致大量活性氧的产生,随着时间的增加,肝脏和鳃组织SOD活性显著升高[33],说明SOD在抵御胁迫时发挥了重要作用。在本实验中运输时间越久,高体鰤幼鱼的CAT表达量越高,可以得出存在污染物摄入情况,在一定程度上反应机体的氧化还原状态,保护机体免受过多损伤。

GSH-PX可以将有毒的过氧化物还原为无毒的羟基化合物,从而保护细胞膜的结构和功能免受氧化物的损伤[34]。有研究表明泥鳅(Paramisgurnusdabryanus)幼鱼在受到胁迫时,GSH-PX的表达水平在肝脏中显著增加[35]。本研究中高体鰤幼鱼肝脏中GSH-PX的表达水平较高,在运输6 h时肝脏中GSH-PX的表达水平达到最高值,表明此时肝脏通过消耗机体GSH-PX来抵抗氧化应激。MDA作为脂质过氧化产物,反映机体的氧化损伤程度[36]。在郝晨光等[37]研究中发现,克氏原螯虾(Procambarusclarkii)在模拟运输时,体内的MDA含量显著升高。本实验中,高体鰤幼鱼受到运输胁迫后,鳃中MDA浓度呈逐渐上升趋势,并在12 h时显著高于其余两组,说明随着运输时间的增加,高体鰤幼鱼体内脂质过氧化程度加剧,与郝晨光等研究结果一致。在这过程中产生大量的ROS来不断激活自身的抗氧化系统,所以导致SOD活性升高来清除ROS。尽管抗氧化酶活性不断升高,但仍不能清除过多的自由基。谷胱甘肽还原酶(GSR)是一种重要的抗氧化酶,其在生物体的抗氧化系统中起着关键的作用,参与机体内的多种生物过程[38]。在本研究中,高体鰤幼鱼肝脏内GSR酶活性随着运输时间增加不断升高,可能是由于环境因素的变化使幼鱼产生应激反应,运动加剧促使体内发生氧化还原反应,从而使GSH酶活性升高。

3.5 不同运输时间对高体鰤幼鱼免疫的影响

免疫是动物以维持自身稳态为目的而进行的一种特异性的生理反应,分为先天性免疫和适应性免疫。先天免疫构成鱼类抵御外界病原体感染的第一道防线。适应性免疫是负责对特定病原体产生特异性免疫的应答,两者在防御中起着重要的作用。在细胞因子方面,肿瘤坏死因子(TNF-α)是一种巨噬细胞、单核细胞和分化T细胞产生的促炎细胞因子,还是一种能够直接杀伤有害细胞却对正常细胞无明显毒性的细胞因子。在王维政等[25]研究中发现,军曹鱼在受到胁迫时,TNF-α的表达水平在鳃和肝脏中均出现了显著下降的趋势。本研究高体鰤幼鱼在运输过程中,TNF-α的表达表达水平在12 h鳃中出现了显著上升的趋势,但在肝脏中呈先上升后下降趋势,表明运输胁迫中TNF-α参与高体鰤幼鱼鳃和肝脏的免疫调控,与军曹鱼研究结果不一致。

核因子KB(NF-KB1)是机体重要的转录因子,抑制下游促炎性因子,激活后产生细胞因子。本研究中,NF-KB1在模拟运输12 h后在高体鰤幼鱼肝脏中表达量最高,随着时间的增加而升高,其在鳃的表达中,8 h时表达量最高,12 h时开始下降,说明在氧化应激的状态下,导致高体鰤幼鱼机体炎症反应发生,使机体受到损伤。免疫球蛋白重变量(IGT)和主要组织相容性复合物(MHC-1)属于抗体,IGT是适应性免疫分子之一;MHC-1分子在抗原呈递和免疫调节中起重要作用,在脊椎动物免疫应答中起关键作用,主要识别细胞内抗原,引发适应性免疫。在刘桓君等[39]的研究中发现,大弹涂鱼(Boleophthalmuspectinirostris)在受到胁迫时肝脏中的MHC-1表达水平显著上升。在虹鳟鱼病毒感染期间检测到MHC-1具有相应的调节作用[40]。在本研究中,运输12 h后高体鰤幼鱼鳃中MHC-1的表达水平显著下调,在肝脏中MHC-1的表达水平显著上调,说明在高体鰤幼鱼在受到运输胁迫时,鳃已经适应此时的运输环境,而肝脏中MHC-1基因在帮助鱼体内清除病毒和其他病原体的感染。与研究结果相似,表明MHC-1在免疫应答的过程中起着重要作用。IGT的表达量随着时间的增加而升高,说明应激导致IGT受环境刺激影响,起到防御作用。有研究表明,在模拟运输时,会导致牛血清中IFN-γ浓度升高[41],但在本研究中,高体鰤幼鱼鳃中IFN-γ浓度呈下降趋势,表明在模拟运输4 h时受到应激刺激,导致鱼体为增强免疫功能使谷胱甘肽还原酶浓度升高,但随着时间增加,由于适应此时环境,体内IFN-γ浓度也随之下降,与肉牛血清研究结果不一致。

4 结论

本实验研究了运输时间对高体鰤幼鱼应激、代谢、抗氧化和免疫的影响,得出以下结论:在相同密度(24.7 kg/m3)、不同运输时间下(4 h、8 h、12 h)的模拟运输实验中,总死亡尾数不超过一尾,说明了高体鰤幼鱼对运输胁迫具有一定的抗逆性。但为了减少运输胁迫对鱼苗肝脏、鳃造成的损伤,建议运输时间不应超过8 h。