陆地棉种质黄萎病抗性生理鉴定分析

程利华,杨红兰, 马清倩, 史 莹,张大伟,Alisher A. Abdullaev,张道远

(1.新疆农业大学农学院/棉花教育部工程研究中心,乌鲁木齐 830052;2.新疆抗逆植物基因资源保育与利用重点实验室/中国科学院新疆生态与地理研究所,乌鲁木齐 830011;3.石河子大学生命科学学院,新疆石河子 832003;4.新疆农业科学院经济作物研究所,乌鲁木齐 830091;5. Center for Advanced Technologies under Ministry of Innovative Development of Uzbekistan,Uzbekistan 100174)

0 引 言

【研究意义】20世纪90年代初棉花黄萎病爆发,发病面积达266.67×104hm2[1、2]。2002年全国统计棉花黄萎病发病面积300×104hm2[3]。2009年我国黄萎病发病面积约占植棉总面积的50%,每年损失皮棉7.5×104～10×104t[4]。目前尚未有防治棉花黄萎病的特效药剂,选育和利用抗病品种是控制该病害最为经济有效的手段[5]。【前人研究进展】枯黄萎病混生病圃连续多年的定向选择,培育出棉花抗黄萎病育种的优良种质材料冀616和冀171等[6]。通过病圃连续选择杂种世代材料,育成的陕棉抗病种质对棉花枯、黄萎病具有较高的抗性[7]。近年来在棉花黄萎病发病机理及抗性获得机制上也有研究[8-11]。植物体通过水解酶等酶类破坏病菌的侵染结构从而获得抗性,通过抗菌蛋白GAFP、β-1,3-葡聚糖酶和几丁质酶、Hcm1、多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(PGIP)等[12-16];病菌促使植物体产生大量的ROS(活性氧物质)信号协助侵染[9],植物通过氧化还原酶清除多余ROS,降低细胞膜脂的过氧化作用,减少细胞膜的损伤,和保障细胞正常的生理功能,迫使病菌定殖失败而获得抗性,还原酶包括过氧化物酶(POD)、谷胱甘肽硫转移酶(GSTs)、超氧化物歧化酶(SOD)、多酚氧化酶(PPO)、NADPH氧化酶RBOH、苯丙氨酸解氨酶(PAL)、多胺氧化酶PAO等[17-21];通过木质素的机械屏障阻碍病菌入侵[15、16];通过脯氨酸(PRO)渗透调节物质保障细胞的抗性能力[22]。【本研究切入点】目前存在黄萎病遗传资源狭窄的问题,需引进黄萎病抗性种质,鉴定棉花品种及其种质资源的抗病性,扩充黄萎病抗性棉花种质资源储备。【拟解决的关键问题】以10份国外棉花种质(Gossypiumhirsutum)为材料,室内盆栽棉花接种大丽轮枝菌(VerticilliumdahliaeKleb),研究其形态及生理层,分析棉花品种抗性与棉花黄萎病发生的关系,筛选优质黄萎病抗性品种,为进一步品种选育提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

10份陆地棉棉花材料和大丽轮枝菌(VerticilliumdahliaeKleb.菌株编号为V991)均由新疆抗逆植物基因资源保育与利用重点实验室提供。表1

1.2 方 法

1.2.1 室内盆栽

棉种催芽:棉种先用浓硫酸脱绒,用清水洗净;其次选择籽粒饱满、成熟的种子泡在无菌水中,放置在30℃恒温培养箱中过夜。

基质装盒:按此比例(南山黑土∶草炭土∶蛭石∶珍珠岩=5∶3∶1∶1)配制基质,高压灭菌121℃,25 min;用水湿润基质,使基质含水量达到自身重量的60%为宜(即将基质手捏成团,手指间不见流水,落地后自然散开)。再将湿润的基质装入小方盒中,小方盒稍做抖动,用手指将盒中基质轻轻压实,盒中基质表面离盒面1.0～1.5 cm;每18盒装入1个蓄水盘中。

棉苗播种:选择露白的种子播种,每盒播5粒(四角和中心各1粒),根尖朝下,轻轻插入基质中。每个材料6盒,播种完后用基质进行覆盖,基质与小方盒面相平;每周根灌水2～3次。

1.2.2 大田种植

10份棉花材料于2019年在新疆玛纳斯棉花基地试验田栽种,田间日常管理按常规管理进行,统计其发病率与发病指数。

1.2.3 大丽轮枝菌菌液准备

将4℃冷藏保存的V991转移至固体的察氏培养基中,于25℃培养箱培养7 d,切下0.5 cm2大小的菌块接种于液体的察氏培养基中,使用500 mL三角瓶,装入200 mL察氏培养基和适量玻璃珠进行摇菌。25℃振荡(120 r/min)培养3 d左右,用3层纱布过滤后,用血球计数板估算孢子数量,用无菌水稀释至菌体浓度为107CFU/mL,备用[23]。

1.2.4 接菌处理

选择下午19:00左右接菌处理,按照王省芬等[24]六棱塑料钵定量注菌液法做简单修改后进行接菌处理,棉花接菌时期在2～3真叶期,每个供试株系挑选长势一致的放入一个蓄水盘中,每个小方盒四周均用小木棍插入底部进行伤根处理,每一个小方盒中加50 mL菌悬液,从小木棍插入口的轻柔缓慢的导入基质中,静置过夜,2 d后开始正常浇灌。

1.2.5 表型及病情

棉苗接菌14 d时进行表型拍照和病情统计,所得图片采用Photoshop软件处理;植株发病等级共分为5级:0级,健康,无症状;1级,发黄或枯萎叶片小于25%;2级,发黄或枯萎叶片为25%～50%;3级,发黄或枯萎叶片为50%～75%;4级,发黄枯萎叶片大于75%[25]。计算发病率和发病指数[26]。

病情指数=

1.2.6 生理指标

棉苗用于生理指标测定的样品收集时间分别为接菌0、14 d;收集的棉苗的顶叶(同一部位),所有样品均用锡箔纸包裹,做好标记,液氮冷激,放置超低温(-80℃)冰箱中保存备用。所得样品的生理指标(H2O2、MDA、PAL、PRO及木质素)均用南京建成生物技术有限公司的相应试剂盒测定;数据均由3次重复的平均值和标准误组成,采用Duncan法对数据进行多组样本间差异显著性分析。

1.2.7 DNA的提取

用于提取总DNA的棉苗样品收集时间分别为接菌0、14 d;收集的所有样品均用锡箔纸包裹,做好标记,液氮冷激后,放置超低温(-80℃)冰箱中保存备用。棉花总DNA提取采用试剂盒中植物组织磁珠法,该试剂盒购买于生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2.8 实时荧光定量PCR定量分析

标曲制定:以大丽轮枝菌为模板,采用大丽轮枝菌特异引物(VDIGS-F:5'-CGAATAGGCACACTCAGATTACCC-3';VDIGS-R:5'-TCGCCACAACCTCGATTCCAC-3'),PCR扩增获得特异条带,克隆至T载体,测序鉴定序列可靠性。提取测序正确的克隆菌株中的质粒,检测质粒浓度后稀释10-1～10-8倍,取2 μL为模板,定量PCR制定标曲。

用荧光定量PCR仪测定棉苗叶片中菌体总DNA含量,稀释至同一浓度(20 ng/μL),取出2 μL为模板,加入0.5 μL大丽轮枝菌特异引物,以及定量PCR预混液(Takara,大连),总体积为20 μL。以标曲为参照,定量分析PCR。表2

表2 实时荧光定量PCR体系

在冰上配制上述体系并混匀,进行Real time PCR反应。

实时荧光定量PCR反应程序为:95℃预变性30;95℃变性5,60℃退火30,40个循环;65℃ 5荧光检测;65～95℃,0.5℃(0.05)溶解曲线荧光检测,以获取溶解曲线。

1.3 数据处理

运用Excel 2010进行数据整理,采用 SPSS 19.0软件进行方差、相关性和主成分及聚类分析;采用SigmaPlot 12.5软件进行作图。

将数据进行同趋势化处理,进行正向化处理,例如,将X进行1/X变换[27]。不同棉花品种各综合指标的隶属函数值μ(Xj)的计算见公式(1);各综合指标的权重系数Wj的计算见公式(2);各棉花品种抗性的综合评价(D)的计算见公式(3)。应用主成分分析法结合隶属函数进行综合分析。综合指数值D越大,黄萎病抗性越好。

(1)

(2)

(3)

式中,Xj表示第j个综合指标;Xmin表示第j个综合指标的最小值;Xmax表示第j个综合指标的最大值。Wj表示第j个综合指标在所有综合指标中的重要程度即权重;Pj为各棉花品种第j个综合指标的贡献率。D值为各棉花品种由综合指标评价所得的黄萎病抗性综合评价值。

2 结果与分析

2.1 大丽轮枝菌胁迫下棉花表型动态变化

研究表明,不同株系的棉花出现明显的黄萎病症状。在接菌后14 d左右,其中A-1139、04219和05189品种(系)发病情况较重(发病率> 90%), 05160、04219和A-924次之,其他品种(系)发病情况较轻。图1

03804、05160、A-6 3个品种病情指数在30～50;其次是A-91、04841、04219、05189和A-688病指在50～70;最后是A-1139和A-924病指达到70以上。03804、05160和A-6病指在20左右,A-91、04219、05189和A-688,病指在25～50,04841、A-1139和A-924病指在50以上。图2

图1 棉苗在大丽轮枝菌(菌液107 个/mL)接菌后0、14 d的表型动态

注:(a)室内棉苗接大丽轮枝菌14 d病情指数,(b)大田病情指数;CK:对照组,T:处理组;不同字母(a,b…)代表各种质组间在0.05水平上差异显著,P<0．05,下同

2.2 棉花叶片含菌量qPCR变化

研究表明,棉花各材料之间存在显著差异。03804、A-6、A-91、A-924含菌量相对较低;其次是A-1139、05189、04841,最后是A-688、05160和04219,三者含菌量较高。图3

2.3 大丽轮枝菌对棉苗生理生化指标的影响

研究表明,10份材料在接种病原菌后,与CK相比其H2O2、MDA、PAL和PRO含量均显著上升;而木质素含量不存在显著差异。

各种质之间H2O2存在显著差异,其中05189 材料含量最高,达到1 337 μmol/g ;而03804明显低于其他种质。与CK相比,05160、04841、A-924、A-91、05189、04219、A-1139、A-6及A-688 的H2O2含量呈显著差异,其中05189 材料H2O2变化量也最大,高达8倍。

各种质之间MDA存在显著差异,其中A-924材料含量最高,达到69 nmol/g;与对照相比,05189和A-924的丙二醛含量呈显著差异,05189材料的MDA变化量最大,高达4倍。

各种质之间PAL存在显著差异,05189 材料含量最高,达到38 U/g。经黄萎病胁迫后,与CK相比,苯丙氨酸解氨酶活性呈上升趋势,05160、04841、A-924、A-91、05189、04219、A-1139、A-6及A-688的苯丙氨酸解氨酶活性呈显著差异,其中A-688材料的PAL变化量最大,高达6倍。

注: (a) 接大丽轮枝菌菌液14d叶片含菌量qPCR分析 (b)qPCR标曲

各种质之间PRO存在显著差异,A-924 材料含量最高,达到135 μg/g;经黄萎病胁迫后,棉花叶片中的脯氨酸呈上升趋势,与CK相比,03804、04841、A-924、A-91、04219、A-1139、A-6及A-688的脯氨酸含量呈显著差异。其中A-688材料的PRO变化量最大,达到8倍。

03804材料木质素含量最高,是其他材料的1-3倍。经黄萎病胁迫后,与CK相比,棉花叶片中的木质素含量无明显变化,各品种(系)之间不存在显著差异。图4

2.4 棉花黄萎病抗性指标的相关系数矩阵

研究表明,当棉花受到大丽轮枝菌侵染后,丙二醛、过氧化氢、苯丙氨酸解氨酶以及发病率四者相互呈显著正相关;木质素与过氧化氢、发病率呈显著负相关。表3

2.5 棉花黄萎病各综合指标、生理指标主成分

研究表明,得到了5个新的相互独立的综合指标和贡献率。选择两个主成分,得到棉花各生理指标的主成分系数,即PC1、PC2,贡献率分别为64.951%,20.386%,两者累计贡献率达到85.337%。表4,表5

表3 棉花黄萎病抗性指标的相关系数矩阵

注:CK:对照组,T:处理组;‘*’‘ **’:分别表示种质组内P<0．05和P<0.01,下同

2.6 抗性综合评价

研究表明,对于同一综合指标,如Y1,03804的U(X)最大,为1,该品种在这一综合指标上表现为抗性最强;而05189的U(X)最小,为0,该品种在这一综合指标上表现为抗性最差。U(X1)、U(X2)的权重分别为0.761,0.239。

05189棉花样品D值最小,在参试的10个不同品种棉花中其抗性最差;03804棉花品种D值最大,其黄萎病抗性最强。将这10份材料分成Ⅲ类:其中,03804为第I类,属于抗性材料;A-688、A-91、A-924、A-6、05160属于第Ⅱ类,为耐病材料;04841、05189、04219、A-1139为第Ⅲ类,属于黄萎病敏感材料。该聚类结果与田间病指相符合。表6,图5

表4 棉花黄萎病各综合指标的特征值、贡献率及累计贡献率

表5 棉花黄萎病抗性各生理指标的主成分矩阵

表6 棉花各品种黄萎病抗性的综合指标值Y、权重、U(Xj)、D值及综合评价

图5 10份棉花种质资源黄萎病抗性聚类

3 讨 论

3.1 室内与大田的病情指数差异

主成分分析可将原来多组单个指标组合成一组新的相互独立的主成分单元,在损失较少原有信息的前提下,通过降维的方法浓缩数据和简化指标,揭示变量间的关系[28]。影响棉花黄萎病发生的因素有棉花品种抗性水平、栽培措施、气象因子、病原茵致病性及数量积累等[29]。棉花区试田间病情调查结果与人工病圃鉴定结果存在较大差异,不同的抽样规模和抽样方法对品种的抗病性评价有显著影响[30]。采用沾根或伤根灌窝接菌,待发病达高峰时,田间病床早期鉴定与大田病圈的抗性一致,苗期黄姜病鉴定与花铃期病情指数达极显著相关,是棉花抗病育种早期杭性筛选和鉴定的有效方法[31]。研究中室内和田间的种植环境与数量都有着巨大差异,病情统计方法也有所不同,两者的病情指数产生一定差异。两者趋势相同,室内植株的病情指数可以反映植株之间的抗性情况。室内指标综合抗性排序结果与大田病指基本相符合,室内棉花黄萎病鉴定方法可靠。

3.2 棉花黄萎病抗性生理指标响应

当作物接种大丽轮枝菌后,可以触发了许多短期和长期的防御机制,包括H2O2的产生、PAL的活性,PRO的积累以及苯丙素代谢和木质素的合成等各方面[22、32-37]。试验中棉株接菌后MDA、PAL和木质素的变化,与侯丽娟等[38]的研究结果相相符即棉株接菌后MDA、PAL和木质素显著增加。

H2O2是细胞过氧化的产物,指示细胞的活性氧(ROS)累积程度,细胞受到胁迫随之增加[35]。MDA是膜脂过氧化的最终产物,会对细胞膜造成损伤,在病害胁迫下,植物体内膜脂过氧化作用增强,MDA含量增加[36]。研究中,两者呈极显著正相关,两者均可以表示棉花叶片受伤害的程度,而木质素是作为物结构组成中重要的大分子,对机械支撑和水运输至关重要,对害虫和微生物起到一定防御作用,可提高作物的抗逆性[33、34]。研究中03804是所有材料中相对抗性最好的材料。可能是由于03804叶片中木质素含量较高,而其 H2O2、PAL和MDA与其他品种(系)相比较低。03804中木质素在一定程度上发挥了阻止病原菌侵入的作用。PAL与木质素的合成密切相关[39],木质素的合成来自苯丙氨酸,而PAL是苯丙烷类代谢途径中的关键酶,与植物的抗病性有密切关系[37]。试验中棉花叶片中的苯丙氨酸解氨酶显著增加,棉苗接种黄萎病菌后,植物的防卫系统特别是苯丙烷类代谢被激活,PAL活性迅速上升。当作物受到生物胁迫或分生物胁迫时,都会导致植物体内脯氨酸的积累[40-42]。试验中棉花叶片中的脯氨酸含量也呈显著增加,棉花受到黄萎病菌胁迫时,体内会积累大量脯氨酸。脯氨酸除了作为植物细胞质内渗透调节物质外,还在稳定生物大分子结构、降低细胞酸性、解除氨毒以及作为能量库调节细胞氧化还原等方面起重要作用[22]。脯氨酸的积累有可能提高作物的抗性。

根据降维后的综合指标值的贡献率求出其相应的隶属函数值,并依据各综合指标的贡献率(权重)进行加权,得到各品种(系)抗病性的综合评价值(D值)。由于D值是一个无量纲的数,从而使各品种的抗病性的差异具有可比性[43]。赵晓军等[44]利用主成分分析法评价燕麦品种,可以简洁明了地对试验品种的优劣进行排序,并且可以摒弃不同度量指标因量纲不同带来的差异,可以有效减少系统误差,提高试验的准确性。葛礼娇等[45]利用主成分分析和隶属函数分析确定筛选菊花苗期氮高效品种的最适供氮水平和评价指标,筛选菊花苗期氮高效品种南农丽黄、南农小金帽、南农丰收、南农旭日、南农庐月。试验通过主成分分析和隶属函数分析得到的结果具有一定的可靠性。

4 结 论

不同株系的棉花出现明显的黄萎病症状,筛选出抗黄萎病较强的棉花种质资源。03804由于木质素含量高,降低细胞伤害,抵御病菌的入侵,降低发病率,为抗性棉花材料。A-688、A-91、A-924、A-6和05160五个品种(系)通过积累的脯氨酸,调节细胞质内渗透,降低伤害,属于耐病材料;04841、05189、04219和A-1139产生大量过氧化氢与丙二醛,造成细胞膜严重受损,为敏感材料。