祁白术多糖的微波-超声协同提取工艺优化与测定方法研究

吴永祥卢玮玮蒋小旋江国庆程雪翔陈敏楠陈向阳

(1.黄山学院生命与环境科学学院，安徽 黄山 245041；2.黄山市新安医学研究中心，安徽 黄山 245000；3.北京安汀医药生物科技有限公司，北京 101500；4.黄山曼迪新药业有限公司，安徽 黄山 245700)

祁白术为菊科植物白术的干燥根茎，为安徽省著名道地药材，与祁门红茶、祁门蕲蛇齐名，是徽州“三祁”之一[1]。祁白术富含多酚、黄酮、挥发油、内酯类物质和多糖等生物活性物质[2-5]，具有抑菌、抗氧化、抗炎症、调节脂质代谢及免疫增强等现代药理作用[6-8]。皖药祁白术的“质优效佳”与其特殊气候、地形、土壤等生态环境因子密切相关[9]。多糖是祁白术中一种非常重要的次生代谢产物，是其发挥抗氧化、免疫调节等作用效果的物质基础[8，10，11]。

目前，白术多糖的主要提取方法有热水浸提法、酸提取法、超声波提取法、酶法等。由于多糖大多包裹在植物细胞壁中，单一的传统提取方法无法使细胞壁完全破裂，使多糖的溶出存在较大阻力，导致多糖得率低和提取成本高[12]。微波-超声协同法是将微波和超声波这2种作用结合的一种新的提取方法，具有提取时间短、能耗低和得率高等优点[13]。目前，尚未见微波-超声协同提取祁白术多糖的研究报道。因此，本试验探讨微波-超声协同作用对祁白术多糖提取的影响，优化提取工艺，并比较苯酚-硫酸法与蒽酮-硫酸法测定祁白术多糖含量的差异，旨在确定合理可行的祁白术多糖提取工艺和含量测定方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

祁白术，于2017年8月在安徽省祁门县古溪乡采集，经黄山学院植物学专家方建新老师鉴定，确认为野生祁白术(Atractylodes macrocephala Koidz.)的干燥根茎；无水乙醇，分析纯，上海玻尔化学试剂有限公司；苯酚，分析纯，西陇化工股份有限公司；蒽酮，分析纯，上海科丰化学试剂有限公司；浓硫酸，分析纯，西陇科学股份有限公司；葡萄糖，分析纯，天津博迪化工股份有限公司。

1.2 仪器与设备

数控加热功率可调型超声波清洗器，SCQ-5201C型，上海声彦超声波仪器有限公司；微波炉，ML-L213B型，美的集团股份有限公司；全波长酶标仪，SpectraMax-190型，美国Molecular Devices公司；电热恒温水浴锅，HWS-28型，上海-恒科学仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 祁白术多糖的提取

取干燥充分的祁白术粉末2.0g，按照料液比1∶40g·mL-1加入蒸馏水，调节微波功率400W，时间设定为90s，然后进行超声波处理，调节超声温度70℃，以150W的功率超声10min。将提取液置于离心管中进行4000r·min-1离心15min，上清液即为祁白术多糖溶液。

1.3.2 苯酚-硫酸法测定多糖含量

参照Cuesta等[14]试验方法，略有改进，取0.5mL样品溶液于具塞试管中，加入0.5mL 5%苯酚溶液和2.5mL浓硫酸，摇匀，在沸水中反应10min，冷却至室温，准确吸取200μL溶液加入96孔酶标板，于490nm波长下测定吸光度。以葡萄糖为标准品，按照上述步骤，绘制标准曲线。

1.3.3 蒽酮-硫酸法测定多糖含量

参照谢心文等[15]试验方法，略有改进，取0.5mL样品溶液于具塞试管中，加入2.5mL蒽酮-硫酸溶液，摇匀，在沸水中反应10min，冷却至室温，吸取200μL溶液加入96孔酶标板，于500nm波长下测定吸光度。以葡萄糖为标准品，按照上述步骤，绘制标准曲线。

1.3.4 多糖提取率的计算

祁白术多糖含量的测定采用苯酚-硫酸法，提取率的计算公式：

式中，Y为祁白术多糖提取率，%；n为祁白术多糖溶液的稀释倍数；C为根据标准曲线计算后的祁白术多糖溶液的质量浓度，g·mL-1；V为提取液的体积，mL；m为祁白术样品的质量，为2.0g。

1.3.5 苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法精确度试验

1.3.5.1 2种方法反应物的吸收光谱

分别取苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法反应后的祁白术多糖及葡萄糖标准品溶液200μL于96孔酶标板，在400～740nm区域内，每隔20nm波长扫描溶液的吸收曲线[16]。

1.3.5.2 稳定性试验

分别取苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法反应后的祁白术多糖溶液200μL于96孔酶标板，采用酶标仪对其进行时间-吸光度曲线扫描，扫描总时间为120min，每隔20nm扫描1次[16]。

1.3.5.3 标准曲线的制作

采用苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法分别测定不同浓度葡萄糖(100μg·mL-1、200μg·mL-1、300μg·mL-1、4000μg·mL-1、500μg·mL-1)的吸光值，以葡萄糖浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。

1.3.5.4 加标回收率试验

精密量取已知浓度的祁白术多糖溶液8份，分为2组加入试管中，在分别加入1mg·mL-1葡萄糖溶液0.1mL，采用苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法测定其吸光值，分别计算加标回收率[17]。

1.3.6 单因素试验设计

各因素的试验梯度分别为微波功率0W、100W、150W、400W、550W、700W；微波时间30s、60s、90s、120s、150s；超声功率为0W、100W、150W、200W、250W、300W；超声温度50℃、60℃、70℃、80℃、90℃。在进行单因素试验时，除自身因素变化外，其他因素水平不变。

1.3.7 响应面试验设计

在单因素基础上，选择微波功率(A)、微波时间(B)、超声功率(C)、超声温度(D)为影响因子，多糖提取率(Y)作为评价指标，进行4因素3水平的响应面分析，因素水平见表1。

表1 因素水平

1.4 数据统计与分析

采用Design-Expert 8.0.6软件进行响应面设计及方差分析。运用SPSS 18.0统计软件中单因素方差分析的Duncan’s多重比较法分析数据间的显著差异，P<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 吸收光谱的比较

由图1可知，采用苯酚-硫酸法对祁白术多糖和葡萄糖进行测定时，祁白术多糖与葡萄糖在490nm波长处有明显的最大吸收峰，且两者的吸收曲线形状一致，说明祁白术多糖在苯酚-硫酸作用下生成橙红色化合物组分较单一，显色效果较好。在蒽酮-硫酸法测定试验中，祁白术多糖及葡萄糖标准品溶液在500nm左右出现较高吸收峰，但与苯酚-硫酸法相比，最大吸收峰不明显，而且干扰峰较多。

注：1表示祁白术多糖；2表示葡萄糖。

2.2 稳定性试验结果的比较

由图2可知，采用苯酚-硫酸法显色的祁白术多糖吸收曲线在20min内较为稳定，但随着时间的延长而出现较小波动，相对偏差为3.53%，分析原因可能是祁白术多糖与苯酚-硫酸作用生成的络合衍生物易受外界因素(温度、湿度、时间等)的影响。祁白术多糖与蒽酮-硫酸试剂显色后，吸收曲线波动不大，在120min内都较为稳定，相对偏差为0.34%。

图2 苯酚-硫酸法(a)和蒽酮-硫酸法(b)测定祁白术多糖的稳定性比较

2.3 标准曲线试验结果的比较

由图3可知，蒽酮-硫酸法葡萄糖的回归方程为Y=0.0025X+0.0209(R2=0.994)，苯酚-硫酸法葡萄糖的回归方程为Y=0.0043X+0.0278(R2=0.999)。在100～500μg·mL-1范围内，苯酚-硫酸法的线性关系更好。

2.4 加标回收率试验结果的比较

由表2可知，苯酚-硫酸法的平均回收率和标准偏差分别为100.38%、0.51%，均优于蒽酮-硫酸法的104.82%、4.17%。通过上述试验结果比较发现，苯酚-硫酸法测定祁白术多糖的线性关系、精密度及加样回收率结果均优于蒽酮-硫酸法，更适合于祁白术多糖的测定。本试验选择苯酚-硫酸法进行下一步祁白术多糖提取工艺的优化试验。

2.5 单因素试验结果

2.5.1 微波功率对祁白术多糖提取效率的影响

固定微波时间90s、超声功率150W、超声温度70℃，考察微波功率0W、100W、150W、400W、550W、700W对祁白术多糖提取率的影响，结果见图4。微波功率为150W时，多糖提取率达到最大，为(38.50±0.18)%，而未进行微波处理组，多糖提取率仅为(26.24±2.38)%，多糖提取率显著提高了46.71%，具有统计学差异(P<0.05)。当微波功率超过150W时，祁白术多糖提取率随着微波功率的增加而减少，可能是由于微波功率过高加速物料表面焦化，导致多糖溶出受阻[18]。

注：图中不同字母表示在统计学上具有显著差异(P<0.05)；下同。

2.5.2 微波时间对祁白术多糖提取效率的影响

固定微波功率400W、超声功率150W、超声温度70℃，考察微波时间30s、60s、90s、120s、150s对祁白术多糖提取率的影响，结果见图5。祁白术多糖提取率在微波时间达到60s时最大，为(39.62±2.21)%，之后多糖提取率随着微波时间的增加而下降显著(P<0.05)。

图5 微波时间对祁白术多糖提取率的影响

2.5.3 超声功率对祁白术多糖提取效率的影响

固定微波功率400W、微波时间90s、超声温度70℃，考察超声功率为0W、100W、150W、200W、250W、300W对祁白术多糖提取率的影响，结果见图6。超声功率在0～200W范围内，多糖提取率随着超声功率的增大而增加，当超声功率为200W时，多糖提取率达到最大，为(38.33±0.55)%，相比于未进行超声处理组，多糖提取率显著提高(P<0.05)。随后，祁白术多糖提取率随着超声功率的增加而减少，可能是超声功率过高致使多糖糖苷键断裂、多糖结构破坏所致[19]。

图6 超声功率对祁白术多糖提取率的影响

2.5.4 超声温度对祁白术多糖提取效率的影响

固定微波功率400W、微波时间90s、超声功率150W，考察超声温度50℃、60℃、70℃、80℃、90℃对祁白术多糖提取率的影响，结果见图7。祁白术多糖提取率在温度达到60℃时最大，为(36.70±1.26)%，之后多糖提取率随着超声温度的升高而下降显著(P<0.05)。

图7 超声温度对祁白术多糖提取率的影响

2.6 响应面试验结果

2.6.1 Box-Behnken实验设计与结果分析

响应面试验结果见表3。对表3数据进行多元回归拟合，得到以下方程：

表3 祁白术多糖提取率的响应面试验结果

Y=46.93+4.02A+2.32B-1.37C+2.29D+2.05AB-0.017AC+1.82AD-0.72BC-0.50BD+0.63CD-6.28A2-2.08B2-3.96C2-5.03D2

2.6.2 回归模型的方差分析

表4 祁白术多糖提取率的回归模型方差分析

2.6.3 验证性试验结果

根据统计分析结果，并考虑到生产操作的实际情况，优化后的最佳提取工艺为微波功率400W、微波时间84s、超声功率200W、超声温度63℃。通过验证试验，测得祁白术多糖提取率为48.53%，与预测值49.30%的相对误差为1.59%，表明该方法稳定可靠，预测性良好。

3 结论与讨论

本试验分别采用苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法对祁白术多糖含量的测定进行了比较，通过最大吸收波长扫描、线性关系、精密度及加样回收率试验发现苯酚-硫酸法准确可靠、重复性好，优于蒽酮-硫酸法，更适合于祁白术多糖的测定。相比于高效液相色谱法、酶法等，苯酚-硫酸法操作简单、样品无需繁琐前处理、检测费用低、实用性强，具有更好的使用价值[20]。

本试验通过响应面法优化祁白术多糖的微波-超声协同提取工艺，得到最佳工艺条件为微波功率400W、微波时间84s、超声功率200W、超声温度63℃，多糖提取率高达48.53%。胡长玉等[21]采用传统热水浸提法提取祁白术多糖，通过正交设计分别优化了祁白术水提及醇沉工艺，得到祁白术多糖提取率31.55%，低于本试验结果的48.53%，表明微波-超声协同提取工艺能显著提高了祁白术多糖的提取效率。然而，不同产地白术的多糖、多酚、黄酮、挥发油和内酯类物质等生物活性物质主要受产地环境的影响，其含量与种类差异显著[22-24]，如浙江临安白术多糖含量为24.93%、贵州余庆白术多糖含量为29.49%、湖北咸丰白术多糖含量为22.25%、四川产地白术多糖含量为34.30%。综述所述，本试验揭示了祁白术多糖的测定方法及优化了微波-超声协同提取工艺，为皖药祁白术资源的综合利用开发提供了一定的理论基础。