茯苓配方浸膏对高脂饮食小鼠肥胖及脂质沉积的影响

胡岳云，谢忠稳，袁静静，李庆林*

茯苓配方浸膏对高脂饮食小鼠肥胖及脂质沉积的影响

胡岳云1,2，谢忠稳3，袁静静1，李庆林1*

(1. 安徽中医药大学新安医学教育部重点实验室，合肥 230038；2.安徽中医药大学药学院，合肥 230012； 3. 安徽农业大学茶树生物资源与利用国家重点实验室，合肥 230036)

为了探究茯苓配方（茯苓、山楂、黄大茶）浸膏对高脂饮食小鼠肥胖及脂质沉积的影响，将 C57/BL 6N小鼠随机分为对照组，模型组，奥利司他药物对照组，茯苓配方（Wolf formula，PWF）浸膏低、高剂量组。除对照组给予低脂饲料，其他组均以高脂饲料喂养12周。每周记录小鼠的体重、能量摄入。给药结束后，计算各组小鼠Lee’s指数、脏器系数，采用苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色法观察各组小鼠肝细胞与脂肪细胞形态变化，全自动生化仪测定各组小鼠血清中TG、TC、HDL-C、LDL-C、AST及ALT水平变化。结果显示，与对照组相比，模型组小鼠体重、Lee’s指数、脏器系数、TG、TC、LDL-C、AST及ALT水平均显著升高（＜0.01或＜0.001），肝脏脂滴数量与脂肪细胞直径增加；与模型组相比，茯苓配方浸膏高剂量组小鼠体重、Lee’s指数和脏器系数均显著降低（＜0.05或＜0.01），低剂量组小鼠体重、Lee’s指数和脏器系数均没有显著变化，茯苓配方浸膏高剂量组小鼠肝脏脂滴数量与脂肪细胞直径减少，TG、TC、LDL-C水平、AST及ALT水平均显著降低（＜0.05或＜0.01或＜0.001）。综上所述，茯苓配方浸膏能够改善高脂饮食小鼠的体重及脂质沉积，为开发改善肥胖的天然物质提供理论基础。

茯苓；山楂；黄大茶；肥胖；脂质沉积

肥胖被定义为体内脂肪过度积累或异常分布，影响人体健康的一种疾病[1]。在过去几十年里，肥胖已经成为了一个日益严重的公共卫生问题[2]，全世界有近20亿成年人被认为超重，其中超过一半的人被归类为肥胖[3]。肥胖与心血管疾病的发病率、死亡率密切相关[4]。然而，目前对于肥胖的治疗手段并不理想，临床上采用的减肥手术或药物通常都具有一定的副作用[5]，危害身体健康。因此，寻找天然的药食同源物质是改善肥胖更为安全有效的策略之一。

肥胖被认为是由于湿浊内生、痰湿内聚诱发的膏脂堆积[6]，因此使用利水渗湿药物可能是改善肥胖的有效方法。茯苓是一种药用食用菌，主要功效为镇静安定、利水渗湿等，临床用于心脏病、肾病等[7]。山楂属于蔷薇科植物，有悠久的食用和药用历史，在中国和欧美等国家被用作传统药物、中草药和膳食补充剂，主要功效为健胃、消食等，临床用于治疗消化不良等[8]。茶是世界上最常用的饮料之一，在茶的发源地中国，4 000多年来茶一直被认为是一种生药[9]。黄大茶由“1芽3～6片叶”轻度发酵制成，是安徽的特产黄茶[10]，具有抗菌、抗癌等作用[11]。作为一种稀有而珍贵的茶叶品种，黄大茶因其醇厚的口感和保健功效，具有很高的研究价值[12]。

在五色养生理论中，黄色在五脏中与脾对应，黄大茶对脾胃有益，可以健脾利湿[13]。在中医辅助传承系统（traditional chinese medicine inheritance support system，TCMISS）、中国期刊全文数据库（CNKI）和中国生物医学（CBM）等数据库收录治疗肥胖的方剂中，茯苓、山楂药对配伍高度关 联[14-16]。改善肥胖的方剂组成思路，主要是健脾祛湿药配伍消食化积药物，因此本实验选择茯苓、山楂、黄大茶配对改善肥胖。

目前尚无茯苓、山楂、黄大茶三者联合用药改善肥胖的相关报道，本实验探讨三者组成配方对于改善高脂饮食诱导小鼠肥胖及脂质沉积的作用，为开发改善肥胖的新产品提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 SPF级C57/BL 6N雄性小鼠40只，体质量10～13 g，购于南京维通利华公司，于安徽省医学科学院SPF级动物实验中心饲养，条件为12 h/12 h明暗交替，室温（22±2）℃，相对湿度（50±5）%，定期更换垫料、饮水。本实验已通过安徽中医药大学动物伦理委员会审查，动物伦理编号为AHUCM-mouse-2020088。

1.1.2 试剂 茯苓（批号20210730；安徽）；山楂（批号20210730；山东）；黄大茶（批号DB34/ T3020-2017；霍山）；奥利司他（批号96829-58-2；麦克林）；组织固定液（合肥臻沃生物医药科技有限公司）；TG试剂盒（货号110-1-1；南京建成）；TC试剂盒（货号A111-1-1；南京建成）；HDL-C试剂盒（货号A112-1-1；南京建成）；LDL-C试剂盒（货号A113-1-1；南京建成）；AST试剂盒（货号C010-2-1；南京建成）；ALT试剂盒（货号C009-2-1；南京建成）

1.1.3 仪器 高速粉碎机（上海汗诺仪器有限公司）；恒温水浴槽（德祥科技有限公司）；KRE-3000 旋转蒸发仪（昆山市超声仪器有限公司）；ALPHA1-2LD 真空冷冻干燥机（德国 CHRIST 公司）；全自动生化分析仪（日立诊断产品上海有限公司）；石蜡自动切片机（湖北省孝感市宏业医用仪器有限公司）；显微镜（德国 OLYMPUS BXS1）；微量离心机（德国Eppendorf）。

表1 动物饲料制备配方

1.2 方法

1.2.1 茯苓配方浸膏及动物饲料的制备 分别称取茯苓 215 g，山楂 108 g，黄大茶 215 g（质量比为2∶1∶2），纯水煎煮1 h，料液比1∶10，重复煎煮3次，抽滤并合并药液，旋转浓缩成浸膏状，–20 ℃保存过夜，真空冷冻干燥，得冻干粉149 g，提取率约为27.7%。低脂饲料参照美国Research Diets 公布的D12450H配方制备，高脂饲料参照D12451配方制备，具体成分见表1。

1.2.2 分组与造模 将小鼠随机分为5组，每组8只，适应性饲养2周，分别为对照组，模型组，奥利司他组（0.03 g·kg-1），茯苓配方浸膏低剂量组（0.6 g·kg-1）、茯苓配方浸膏高剂量组（2.4 g·kg-1），查阅2020版《中国药典》常用剂量换算得来[17]，对照组给予低脂饲料喂养，其他组给予高脂饲料喂养，给药组分别灌胃相应剂量药物，给药12周，对照组和模型组灌胃等体积生理盐水。定期观察各组小鼠的摄食量、毛发、精神状态等。

1.2.4 组织学HE染色 固定在4%多聚甲醛的肝脏及脂肪组织过夜冲水，依次经过不同浓度的乙醇溶液、二甲苯、石蜡脱水包埋，以5mm厚度切片、展片、烤片，将石蜡切片进行脱蜡，不同浓度的乙醇溶液进行复水，苏木精、伊红染色，二甲苯透明，中性树胶封片，光学显微镜下观察组织形态并拍照。

1.2.5 血清指标检测 摘小鼠眼球取血，4 ℃静置6 h，于低温离心机5 000 g，离心5 min，收集上层血清，于–80 ℃保存。根据说明书操作步骤检测各组小鼠血清中TG、TC、HDL-C、LDL-C、AST和ALT水平。

1.2.6 统计学分析 实验数据采用GraphPad Prism 8.0.2进行统计分析，数值以平均值±标准差表示，采用单因素方差分析中的多重比较分析实验数据的显著性。

2 结果与分析

2.1 茯苓配方浸膏对高脂饮食小鼠体重及能量摄入的影响

分析各组小鼠12周的体重及Lee’s指数，与对照组相比，模型组小鼠体重与Lee’s指数显著增加（＜0.001）；与模型组相比，奥利司他组小鼠体重与Lee’s指数显著降低（＜0.001），茯苓配方浸膏高剂量组小鼠体重与Lee’s指数显著下降（＜0.01），低剂量组小鼠体重与Lee’s指数无显著变化。观察各组小鼠能量摄入发现，与对照组相比，模型组小鼠每天能量摄入显著增加（＜0.001）；与模型组相比，奥利司他组、茯苓配方浸膏低剂量组、高剂量组小鼠每天的能量摄入均无显著差异。以上结果见图1及表2，表明高剂量茯苓配方浸膏能够在不影响小鼠能量摄入的前提下，降低小鼠体重。

表2 茯苓配方浸膏对小鼠Lee’s指数的影响（`x ± s, n=6～8）

注：与对照组相比， ###＜0.001；与模型组相比， **＜0.01，***＜0.001；下同。

与对照组相比，#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001；与模型组相比，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；下同。

Figure 1 Effects of PWF extracts on body weight (a) and energy intake (b) in mice (`±=6-8)

2.2 茯苓配方浸膏对高脂饮食小鼠脏器指数及脂 质沉积的影响

分析各组小鼠组织重量及脏器系数发现，与对照组相比，模型组小鼠肝脏、棕色脂肪组织、皮下脂肪组织及附睾脂肪组织的重量及脏器系数均显著增加（＜0.01或＜0.001）；与模型组相比，奥利司他组小鼠肝脏、棕色脂肪组织、皮下脂肪组织、附睾脂肪组织的重量及脏器系数均显著降低（＜0.01或＜0.001），茯苓配方浸膏高剂量组小鼠肝脏、棕色脂肪组织、皮下脂肪组织及附睾脂肪组织的重量及脏器系数均显著降低（＜0.05或＜0.01或＜0.001），低剂量组小鼠各脏器重量及系数均无显著变化，结果见表3、表4。脂肪组织主要含有脂类，参与调节全身代谢[18]，因此观察各组小鼠脂肪组织的脂质沉积情况。HE染色各组小鼠的肝脏及脂肪组织发现，与对照组相比，模型组小鼠的肝脏含有大量脂滴，棕色脂肪组织、皮下脂肪组织及附睾脂肪组织细胞直径增加；与模型组相比，奥利司他组小鼠及茯苓配方浸膏高剂量组小鼠肝脏中脂滴数量减少，棕色脂肪组织、皮下脂肪组织及附睾脂肪组织细胞直径减小，结果见图2。以上结果说明高剂量茯苓配方浸膏能够改善肥胖伴随的脂质沉积。

表3 茯苓配方浸膏对小鼠组织重量的影响（`x± s, n=6～8）

表4 茯苓配方浸膏对小鼠脏器系数的影响（`x± s, n=6～8）

(a) 肝脏HE图（×400）；(b) 棕色脂肪组织HE图（×400）；(c) 皮下脂肪组织HE图（×200）；(d) 附睾脂肪组织HE图（×200）。

Figure 2 Effects of PWF extracts on lipid deposition of Liver (a), Brown adipose tissue (b), Subcutaneous adipose tissue (c) and Epididymal adipose tissue (d) in mice (×400, ×200)

2.3 茯苓配方浸膏对高脂饮食小鼠血脂水平的影响

临床研究表明，肥胖患者的血清中胆固醇（total cholesterol，TC）、三酰甘油（triglyceride，TG）和低密度脂蛋白胆固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）水平较高，高密度脂蛋白胆固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）水平较低[19]，因此进一步检测各组小鼠血清TG、TC、HDL-C和LDL-C水平。与对照组相比，模型组小鼠TG、TC和LDL-C水平均显著增加（＜0.001）；与模型组相比，奥利司他组小鼠TC、LDL-C水平显著降低（＜0.001、＜0.01），茯苓配方浸膏高剂量组小鼠TG、TC和LDL-C水平均显著下降（＜0.05或＜0.001），各组小鼠血清中HDL-C水平无显著差异。实验结果表明高剂量茯苓配方浸膏对肥胖诱发的血脂异常有改善作用。

图3 茯苓配方浸膏对小鼠TG（a）、TC（b）、HDL-C（c）及LDL-C（d）水平的影响（`x ± s, n=6）

Figure 3 Effects of PWF extracts on content of TG (a), TC (b), HDL-C (c) and LDL-C (d) in mice (`±,=6)

图4 茯苓配方浸膏对小鼠AST（a）和ALT（b）水平的影响（`x± s, n=6）

Figure 4 Effects of PWF extracts on content of AST (a) and ALT (b) in mice (`±,=6)

2.4 茯苓配方浸膏对高脂饮食小鼠肝功能的影响

肝脏在脂肪的存储与运输过程中起着重要作用，当脂质代谢失衡时，脂质会积累在肝脏中，造成肝功能损伤[20]。临床应用中，肝酶的水平常被作为评价肝损伤的重要指标，最常用的评估指标是谷草转氨酶（aspartate transaminase，AST）、谷丙转氨酶（alanine transaminase，ALT）[21]。因此，为了考察茯苓配方浸膏对小鼠肝功能的作用，检测各组小鼠血清中AST和ALT水平。与对照组相比，模型组小鼠AST、ALT水平均显著升高（＜0.001、＜0.01）；与模型组相比，奥利司他组小鼠AST、ALT水平降低，茯苓配方浸膏高剂量组小鼠AST、ALT水平显著降低（＜0.01、＜0.05），表明高剂量茯苓配方浸膏对肝功能损伤有改善作用。

3 讨论与结论

茯苓有很高的药用价值，通常与其他物质配伍使用，在许多方剂中都发挥着不可替代的作用，在2015年版《中国药典》中，含有茯苓的制剂约占15%[22]。山楂是药食两用的天然产物，在《中药成方试剂》中收录含山楂的方剂共有308个，其中山楂与健脾祛湿药物联用居多[23]。黄大茶是中国特有的一种微发酵茶，特殊的“密封变黄”制作工艺，使得黄大茶不仅拥有独特的“锅巴香”风味[24]，而且富含多酚、可溶性糖、维生素等物质，具有很高的营养价值。茯苓、山楂和黄大茶均具有很高的食用与药用价值，但在应用时，通常是配伍其他物质发挥功效的。

饮食滞留于脾胃易化生热邪，湿热互结脏腑，导致脾胃运化失调，水湿内停，聚湿成痰，淤积于体内而导致肥胖[6]。临床使用由葛根芩连汤为基础方加减而成的清热利湿健脾方对湿热困脾型肥胖2型糖尿病患者进行治疗[25]，能够显著降低患者的高血糖、高血脂。基于肥胖患者多为痰湿体质，本研究中茯苓、山楂与黄大茶配伍能够发挥健脾利湿功效，改善高脂饮食诱导的小鼠肥胖。

脂肪组织是脂类新陈代谢、储存和分解的主要枢纽[26]，其中白色脂肪组织是一种内分泌器官，通过存储和分泌脂质，影响人体的血脂水平以及新陈代谢。与肥胖相关的高脂血症是一系列心血管疾病和代谢紊乱的危险因素，肥大的脂肪细胞是肥胖的标志，被广泛认为是高脂血症的主要诱因[18]。本研究发现奥利司他及茯苓配方浸膏能够减小高脂饮食小鼠的皮下脂肪、附睾脂肪等白色脂肪组织以及棕色脂肪组织的脂肪细胞肥大，改善脂质沉积，并显著降低血脂TG、TC、LDL-C水平。临床发现，肝脏发生脂肪变性与体重存在正相关性[27]，在约90%的肥胖患者中，肝脏会出现脂肪空泡，发生脂肪变性[20]。肥胖患者的AST及ALT水平通常是显著升高的，血清中ALT水平是评估肝功能障碍的特殊标志[28]。本研究发现茯苓配方浸膏能够减少肝脏中的脂滴含量，改善肝脏的脂肪变性，显著降低AST、ALT的水平，对高脂饮食小鼠肝损伤有一定的改善作用。

研究报道，茯苓多糖、山楂黄酮、咖啡因、表没食子酸儿茶素酸酯均有抗肥胖作用。茯苓多糖能够通过增加胆固醇相关转运蛋白的表达，促进胆固醇代谢来改善高脂饮食小鼠肝脏的脂质沉积[29]；山楂黄酮能够上调激素敏感酯酶（hormone-sensitive lipase，HSL）、甘油三酯水解酶及固醇调节元件结合蛋白-1c等脂解相关基因的表达促进脂肪分解，减少小鼠体脂沉积[30]；咖啡因能够通过抑制腺苷受体和调控交感神经系统增加儿茶酚胺水平来促进脂肪组织中的脂肪分解过程[31]；表没食子酸儿茶素酸酯能够通过促进脂肪细胞中脂肪分解酶，如HSL等的表达抑制脂肪细胞中的脂质积累[32]。因此，推测茯苓配方浸膏可能通过促进胆固醇转运或脂肪分解等脂质代谢途径来改善小鼠肥胖及脂质沉积。

综上所述，本研究发现茯苓配方浸膏能够减轻高脂饮食诱导的小鼠肥胖，改善肥胖伴随的脂质沉积及肝功能损伤，为进一步开发安全有效的改善肥胖的天然产品提供理论基础。

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Effects ofWolf formula extracts on obesity and lipidosis in high-fat diet-induced mice

HU Yueyun1,2, XIE Zhongwen3, YUAN Jingjing1, LI Qinglin1

(1. Key Laboratory of Xin'an Medicine, Ministry of Education, Anhui University of Chinese, Hefei 230038; 2. Medicine School of Pharmacy, Anhui University of Chinese Medicine, Hefei 230012; 3. State Key Laboratory of Tea Plant Biology and Utilization, Anhui Agricultural University, Hefei 230036)

To study the effects of the combined formula (Wolf,N. E. Br., and large-leaf yellow tea, PWF) extracts on obesity and lipidosis in high-fat diet (HFD)-fed mice, C57/BL 6N male mice were randomly divided into five groups: low-fat diet (Control), HFD (Model), Orlistat, the low-dose PWF extracts, and the high-dose PWF extracts. The body weight and energy intake of mice were recorded weekly. After a 12-week treatment, Lee’s index and organ coefficient were calculated. Hematoxylin-eosin (HE) staining visualized morphological changes of hepatocytes and adipocytes. The serum levels of TG, TC, HDL-C, LDL-C, AST, and ALT were detected by an automatic biochemistry analyzer. The results showed that the body weight, Lee’s index, organ coefficient, and levels of TG, TC, LDL-C, AST, and ALT were significantly increased (＜0.01 or＜0.001) as well as the number of lipid droplets of the liver, and the diameter of adipocyte were increased in the HFD model group, compared with the LFD control group. Compared with the model group, the body weight, Lee’s index, and organ coefficient of the high-dose PWF extracts group were significantly decreased (＜0.05 or＜0.01), while the body weight, Lee’s index, and organ coefficient of the low-dose PWF extracts group were no difference. The levels of TG, TC, LDL-C, AST, and ALT were significantly decreased (＜0.05 or＜0.01 or＜0.001) as well as the number of lipid droplets of the liver, and the diameter of adipocyte were decreased in the high-dose PWF extracts group. In conclusion,PWF extracts significantly reduced HFD-induced obesity and lipidosis, providing a theoretical basis for using traditional Chinese medicine in the improvement of obesity.

Wolf;N. E. Br.; large-leaf yellow tea; obesity; lipidosis

R281.5

A

1672-352X (2023)02-0349-07

[URL] https://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1162.S.20230511.1338.042.html

2023-01-15

国家自然科学基金（82204707），安徽省教育厅高校协同创新项目（GXXT-2019-049）和安徽中医药大学人才支持计划项目（2021rcyb004）共同资助。

胡岳云，硕士研究生，E-mail：1900143094@qq.com

通信作者:李庆林，博士，教授，博士生导师。E-mail：liqinglin@ahtcm.edu.cn

10.13610/j.cnki.1672-352x.20230511.021

2023-05-12 09:39:04