珍稀野生大王杜鹃根际土壤细菌群落结构分析

李婧　刘海燕　蒙文萍　周颖　杨朔　周艳

关键词：大王杜鹃：根际土壤：细菌群落结构：高通量测序

中图分类号：S685.21：Q938.1 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2023）03-0095-06

杜鹃属（Rhododendron L.）是杜鹃花科（Eri-caceae）最大的一个属，杜鹃属植物通常被称为杜鹃花，目前全世界约有千余种，广泛分布于亚洲、欧洲和北美洲，主产东亚和东南亚地区。我国拥有最为丰富的野生杜鹃花资源，西南地区更是杜鹃花多样化和多度中心，约有410种，但由于分布狭窄、生境遭受破坏、种群繁衍困难等原因，部分种类的野生杜鹃花资源日益稀缺。大王杜鹃（Rhododendron rex）是野生杜鹃花中较为珍稀的一种，仅分布在西南地区海拔2300～3300米的山坡林中，是我国特有的珍稀原始古老物种，被《中国生物多样性红色名录——高等植物卷》和《世界自然保护联盟濒危物种红色名录》列为易危（vulnerable）等级，《中国植物红皮书——稀有濒危植物》中被收录为国家Ⅱ级保护植物。珍稀濒危植物的遗传学研究一直是讨论热点，相关研究有助于深层次了解物种进化史和濒危机制，进而有效保护濒危物种，但物种的遗传变异不仅与类群分布有关，还受类群的起源、进化、生物学特性及生境条件等因素影响，所以相关研究需要建立在对珍稀濒危物种生境条件充分了解的基础上。

土壤是植物生境的重要组成部分，土壤微生物是生态系统的主要分解者，对土壤质量的改良和养分循环的促进具有重要作用。根际是植物根系周围受根系生长影响的土体，是微生物与宿主植物之间发生相互作用的一个微小区域，在这个微小区域中蕴含着丰富的微生物资源。细菌则是这些微生物资源中数量最多、种类最丰富的类群，有些细菌可以促进植物生长、防治病害，被称为根际促生菌（PGPR），有些则会抑制植物的正常生长。为了探明大王杜鹃生长与其根际土壤细菌之间的互作关系，本研究选取野生大王杜鹃根际土壤作为研究对象，采用高通量测序（Illumina MiSeq）技术对土壤细菌16S rRNA的V3-V4区片段进行测序，拟从分子水平揭示野生大王杜鹃根际土壤细菌群落结构，为今后开展大王杜鹃的根际促生菌分离筛选、人工培育及濒危机制研究奠定基础。

1材料与方法

1.1样品采集

土壤样品于2021年4月采自云南轿子山国家级自然保护区（102°49′56″E，26°4′7″N）。以野生大王杜鹃植株生长点为中心，分别采集5～10、10～15、15～20 cm深度范围的土壤，去除根系外围土壤后采用抖落法轻轻抖落须根上4 mm的土壤作为样品，一个深度范围为一个样品，共3个样品，分别装入无菌自封袋，标记为DW-10 cm、DW-15 cm、DW-20 cm，干冰保存，带回实验室后置于-80℃低温冰箱中保存，备用。

1.2根际土壤细菌基因组DNA提取、扩增与测序

采用OMEGA土壤DNA提取试剂盒（E.Z.N.A^TMMag-Bind Soil DNA Kit）提取樣品总DNA，具体操作方法参照试剂盒说明书。

PCR扩增分两轮进行，以提取到的样品总DNA为模板进行第一轮PCR扩增，采用上游引物341F（5′- CCTACGGGNGGCWGCAG-3′）和下游引物805R（5′-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3′）扩增细菌16S rRNA的V3-V4区片段，PCR扩增反应体系（30μL）：2xHieff Robust PCR Master Mix 15μL，上下游引物（10μmol/L）各1μL，DNA模板1μL，加水至30μL。扩增程序；94℃3 min；940C 30 s，45℃ 20 s，65℃30 s，循环5次；94℃20s，55℃20 s，72℃ 30 s，循环20次；72℃5 min，19℃保温：以第一轮PCR产物作为模板，用P5（5′-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC-3′）和P7（5′-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT-3′）引物进行第二轮扩增，反应体系（30μL）：2×Hieff Robust PCR Master Mix 15μL，上下游引物（10μmol/L）各1μL，DNA模板2μL，加水至30μL。扩增程序：95℃3 min;94℃ 20 s，55℃ 20 s，72℃ 30 s，循环5次；72℃5 min，10℃保温。

经过两轮PCR扩增后的产物通过2%琼脂糖凝胶电泳检测，检测合格后由生工生物工程（上海）股份有限公司采用Illumina MiSeq二代测序平台进行高通量测序

1.3数据处理与分析

通过高通量测序获得的原始测序序列经FLASH和和Trimmomatic软件进行拼接和质量过滤后，再经Usearch和UCHIME去除非扩增区域序列和嵌合体序列，最终获得高质量有效序列。使用QIIME软件将各样品的全部有效序列进行聚类，相似阈值≥97%的序列聚类为一个操作分类单元（OTU） ，并使用Mothur软件进行细菌群落多样性分析。使用FAPROTAX数据库预测根际土壤细菌功能，Microsoft Excel 2007软件处理数据及制作图表。

2结果与分析

2.1根际土壤DNA的提取

提取结果表明，DNA条带清晰明亮，说明提取片段完整，可用于后续分析。使用Qubit 3.0荧光定量仪对DNA浓度进行测定，3个样品的DNA浓度分别为41.6、26.6、28.4 ng/μL，浓度适宜，可满足后续试验要求。

2.2根际土壤测序结果

通过对各样品细菌16S rRNA的V3-V4区片段进行高通量测序，共获得原始序列235 331条，质控后得到有效序列230 150条，基于≥97%的相似阈值对有效序列进行聚类后共获得958个OTU，各样品测序结果见表1。使用OTU稀释曲线对样品测序数据量是否合理进行评估，结果（图1）表明，各样品OTU稀释曲线均逐渐趋于平缓，说明此次测序数据量合理，物种分布均匀，能够反映大王杜鹃根际土壤细菌群落物种多样性。

2.3根际土壤细菌群落Alpha多样性

Chao 1指数和ACE指数表征细菌群落的丰度大小，数值越大表明样品中物种种类越多；Shannon指数和Simpson指数表征细菌群落的多样性高低，Shannon指数越大、Simpson指数越小表明样品中物种多样性越高。由表2可知，DW-20 cm样品的Shannon指数、Chao 1指数和ACE指数均最大，说明15～20 cm深度范围的大王杜鹃根际土壤细菌群落丰度和多样性最大。

2.4根际土壤细菌群落组成

通过对各样品细菌16S rRNA的V3-V4区片段进行高通量测序并聚类后，共获得958个OTU，隶属于19门54纲83目140科188属。从门分类水平来看（图2a），大王杜鹃根际土壤优势细菌类群主要分属于6个门，占比89.67%，依次为变形菌门（Proteobacteria，38.47%）、酸杆菌门（Ac-idobacteria，24.87%）、放线菌门（Actinobacteria，13.90%）、浮霉菌门（Planctomycetes，7.57%）、绿弯菌门（Chloroflexi，2.58%）、疣微菌门（Verru-comicrobia，2.28%）。

从纲分类水平来看（图2b），相对丰度大于1%的共有12个，占比86.73%，依次为α-变形菌纲（Al-phaproteobacteria，30.78%）、放线菌纲（Actinobacteria，13.78%）、酸杆菌纲亚群2（Acidobacteria Gp2，8.96%）、浮霉菌纲（Planctomycetia，7.56%）、酸杆菌纲亚群1（Acidobacteria Gpl，7.43%）、酸杆菌纲亚群3（Acidobacteria Gp3，4.89%）、γ-变形菌纲（Gamma-proteobacteria，4.50%）、纤线杆菌纲（Ktedonobacteria，2.40%）、酸杆菌纲亚群6（Acidobacteria Gp6，1.99%）、β-变形菌纲（Betaproteobacteria，1.65%）、δ-变形菌纲（Deltaproteobacteria，1.49%）、斯巴达杆菌纲（Sparto-bacteria，1.30%）。

从目分类水平来看（图2c），相对丰度大于1%的共有16个，占比82.38%，其中相对丰度较大的8个目依次为根瘤菌目（Rhizobiales，22.50%）、Norank Acidobacteria Gp2（8.96%）、浮霉菌目（Planctomycetales，7.50%）、Norank AcidobacteriaGpl（7.43%）、放線菌目（Actinomycetales， 7.29%）、红螺菌目（ Rhodospirillales，6.41%）、Norank Ac-idobacteria Gp3 （4.89%）、酸微菌目（Acidimicrobi-ales，3.46%）。

从科分类水平来看（图2d），相对丰度大于1%的共有21个，占比76.48%，其中相对丰度较大的8个科依次为Unclassified Rhizobiales（11.67%）、Norank Acidobacteria Gp2（8.96%）、浮霉菌科（Planctomycetaceae，7.50%）、Norank Ac-idobacteria Gpl（7.43%）、慢生根瘤菌科（Bradyrhi-zobiaceae， 4.96%）、Norank Acidobacteria Gp3（4.89%）、Unclassified Rhodospirillales（3.22%）、Roseiarcaceae（3.14%）。

从属分类水平来看（图2e），相对丰度大于1%的共有21个，占比72.99%，其中相对丰度较大的8个属依次为Unclassified Rhizobiales（11.67%） 、Gp2（8.96%）、Unclassified Planctomyc-etaceae（6.67%）、Gp1（6.61%）、慢生根瘤菌属（Bradyrhizobium，4.96%）、Gp3（3.28%）.Unclassi-fied Rhodospirillales（3.22%）、Roseiarcus（3.14%）。

2.5根际土壤细菌群落功能预测

使用FAPROTAX对大王杜鹃根际土壤细菌群落功能注释后共获得24个功能种群分组，其中，相对丰度大于0.1%的有13个，占总丰度的20.28%；其他（Other）功能种群相对丰度小于0.1%，占总丰度的79.720/00 13个相对丰度大于0.1%的功能种群中，化能异养（Chemoheterotro-phy）、需氧化能异养（Aerobic chemoheterotrophy）和固氮作用（Nitrogen fixation）种群的相对丰度最大，均大于1%；其余10个功能种群的相对丰度均小于1%，依次为细胞内寄生物（Intracellular para-sites）、发酵作用（Fermentation）、硝酸盐还原（Ni-trate reduction）、尿素分解（Ureolysis）、硝化作用（Nitrification）、需氧亚硝酸盐氧化（Aerobic nitrite oxidation）、动物寄生或共生体（Animal parasites or symbionts）、人类病原体（Human pathogens all）、芳香族化合物降解（Aromatic compound degrada-tion）、叶绿体固氮（Chloroplasts，图3）。

3讨论与结论

土壤微生物是影响生态系统的重要因子，细菌作为土壤微生物中的主要菌种，其群落结构特征是土壤微生态系统发生变化的敏感响应，也是衡量土壤质量和生态系统稳定的关键因素，对植物的致濒机制和保护有着重要意义。本研究采用高通量测序技术对珍稀野生大王杜鹃根际土壤细菌群落进行测序和分析，初步获得大王杜鹃根际土壤细菌在门、纲、目、科、属分类水平上的优势类群、功能种群分组及相对丰度。测序共获得有效序列230 150条，基于≥97%的相似阈值对有效序列进行聚类后获得958个OTU，隶属于19门54纲83目140科188属，其中，优势菌门为变形菌门（ Proteobacteria）、酸杆菌门（Acidobacte-ria）、放线菌门（Actinobacteria）等6个门，变形菌门相对丰度最高，达38.47%，与殷根深等[22]对锈红毛杜鹃（Rhododen，dron， bureavii）、乳黄杜鹃（R.lacteum）和亮鳞杜鹃（R.heliolepis）、方敏等对马缨杜鹃（R.delavayi）、赵帆等对草莓（Fra-garia ananassa）、周强等对双蕊兰（Dipland-rorchis sinica）的研究结果一致，但不同植物在门分类水平以下的优势菌群存在明显差异，这充分体现了不同植物根际土壤细菌群落丰富的多样性，既有相似的优势菌群，也有各自独特的菌群。

通过研究发现，大王杜鹃根际土壤细菌生态功能以化能异养、需氧化能异养和固氮作用为主，相对丰度分别为6.98%、6.65%和4.31%。已有研究表明，化能异养和需氧化能异养功能是广泛的生态系统功能，更是与碳循环相关的重要生态功能，由变形菌门（Proteobacteria）、酸杆菌门（Ac-idobacteria）和疣微菌门（Verrucomicrobia）等微生物参与执行。变形菌门下有许多可以促进植物生长和进行固氮作用的促生根际菌，例如，鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）可以促进植物生长以及种子萌发，慢生根瘤菌属（Bradyrhi-zobium）和根微菌属（Rhizomicrobium，）都具有固氮作用，伯克霍尔德菌属（Burkholderia）对植物生长不仅具有促进作用，还能抑制病害。本研究在大王杜鹃根际土壤细菌群落中检测到的鞘氨醇单胞菌属、慢生根瘤菌属、根微菌属和伯克霍尔德菌属的相对丰度分别为0.03%、4.96%、0.23%和0.08%，其中，慢生根瘤菌属相对丰度较大，极有可能为大王杜鹃的生长发育提供氮素营养，其余3属的相对丰度较小，是否具有上述生物学功能还需深入探究。此外，本研究在序列分析中发现存在部分未分类细菌（Unclassified Bacteria），这些菌种资源有待采用其它分析手段进一步挖掘和研究。

本研究采用高通量测序技术对珍稀野生大王杜鹃根际土壤细菌群落进行测序和分析，从分子水平揭示了大王杜鹃细菌群落结构，为今后开展大王杜鹃根际促生菌的分离筛选、人工培育及濒危机制研究奠定了基础。