孔雀石绿和隐色孔雀石绿溶液稳定性探讨

马瑞欣

摘 要：探讨了孔雀石绿溶液和隐色孔雀石绿溶液的稳定性与温度、介质的关系。实验结果表明：乙酸铵对孔雀石绿溶液和隐色孔雀石绿溶液的稳定性起关键作用；隐色孔雀石绿溶液较孔雀石绿溶液稳定。隐色孔雀石绿在乙腈中不论室温还是4 ℃均可稳定存在；孔雀石绿在乙腈中不稳定，4 ℃在其溶液中可检测到隐色孔雀石绿，且浓度越低，转化成隐色孔雀石绿的速度越快。

关键词：孔雀石绿；隐色孔雀石绿；稳定性

孔雀石绿是水产养殖中的禁用药物，虽已禁用多年，但仍有检出。孔雀石绿在水生动物体内迅速代谢为隐色孔雀石绿，二者都具有潜在的致癌性、致突变性和致畸性［1］。隐色孔雀石绿消除缓慢，适宜作为监测孔雀石绿的标志物［2］。孔雀石绿和隐色孔雀石绿的结构如图1所示，孔雀石绿易溶于水，隐色孔雀石绿不溶于水，但二者均易发生去甲基化等反应导致降解［3-5］。笔者在多年使用液相色谱荧光检测法［6］和液相色谱-串联质谱法［7］检测孔雀石绿的过程中发现孔雀石绿和隐色孔雀石绿的稳定性与保存介质、温度等有关。本文对此进行了归纳和总结，以期对水产品检测工作者在使用标准溶液和查找检测中出现的问题时提供帮助。

1 实验部分

1.1 主要仪器与材料

LC-20AD液相色谱仪（日本岛津）—QTRAP 4500 三重四极杆质谱仪（美国AB SCIEX）；高效液相色谱仪（Agilent1100，配有荧光检测器）、十万分之一电子天平（SECURA225D-1CN，赛多利斯）。

孔雀石绿草酸盐标准品、隐色孔雀石绿标准品、隐色孔雀石绿-D6标准品（均为Dr.Ehrenstorfer）、孔雀石绿-D5苦味酸盐标准品（WiTEGA）；乙腈（色谱纯，Merck）、乙酸铵（色谱纯，Honeywell）、甲酸（色谱纯，DIKMA）。

实验所用水为超纯水。

1.2 试样制备

1.2.1 标准溶液的配制

用十万分之一电子天平分别称取适量标准物质，其中的孔雀石绿草酸盐和孔雀石绿-D5苦味酸盐需进行折算，用乙腈溶解并定容，配制成100 μg/mL的储备液。临用时稀释成所用浓度的标准溶液。

1.2.2 样品上机溶液制备

在草鱼空白样品中加入隐色孔雀石绿标准溶液，加标量3.0 μg/kg。按照GB/T 20361-2006［6］进行提取，制备上机溶液。

1.3 上机条件

1.3.1 液相色谱条件

色谱柱：ZORBAX  Eclipse XDB-C 18柱（4.6 mm×250 mm，粒度5 μm）； 流动相：乙腈+乙酸铵（pH=4.5，0.125 mol/L）=80+20；流速1.0 mL/min ；激发波长：265 nm，发射波长：360 nm； 柱温：35 ℃；进样量：20 μL 。

1.3.2 液相色谱-串联质谱条件

液相色谱条件：色谱柱 Accucore TM aQ（100 mm×2.1 mm，2.6 μm）； 进样量2 uL；柱温：40℃；样品温度：10 ℃ ；流动相：A.5 mmol/L乙酸铵溶液（含0.3%甲酸），B.甲醇；梯度洗脱：0～1 min 2% B，1～2 min 98% B～80% B，2～4 min 98% B，4～4.1min 98 % B～20% B，4.1～6 min 2% B。

质谱条件：电喷雾离子源（ESI），多反应扫描（MRM）正离子模式，喷雾电压5 500 V，气帘气30 PSi， 碰撞气Medium，温度550 ℃，雾化气55 Psi，辅助加热气55 PSi。质谱条件及参数见表1。

2 结果与讨论

2.1 隐色孔雀石绿的稳定性与介质和温度的关系

由1.2.2得到上机溶液，溶剂为乙腈+乙酸铵（0.1 mol/L ，pH=10.0）=1+1； 20 ng/mL隱色孔雀石绿标准溶液，溶剂为乙腈。上机溶液和标准溶液分别分成两份，一份室温避光存放，一份4 ℃避光存放；用液相色谱荧光检测器分别测定峰面积，结果如图2所示。

由图2可知，隐色孔雀石绿即使浓度较低，2个月内其稳定性不受温度和保存介质的影响；2个月后，室温下保存的样品溶液浓度开始缓慢下降，但室温下的标准溶液和4 ℃下保存的样品溶液和标准溶液可以稳定至少6个月。

2.2 孔雀石绿、隐色孔雀石绿标准溶液4 ℃的稳定性与介质的关系

分别用乙腈、乙腈+5 mmol/L乙酸铵（1+1）、水分别稀释孔雀石绿、隐色孔雀石绿标准溶液至100 ng/mL单标，4 ℃保存。上机测试前用乙腈+5 mmol/L乙酸铵（1+1）分别稀释成10 ng/mL的溶液，按照1.3.2条件测定其浓度。另外配置10 ng/mL的标准溶液单点法进行定量，结果见图3。

由图3a可知，4 ℃时100 ng/mL孔雀石绿只有在乙腈+5 mmol/L乙酸铵（1+1）溶液中才可稳定存在2个月；由图3b可知，4 ℃时100 ng/mL隐色孔雀石绿在乙腈+5 mmol/L乙酸铵（1+1）溶液和乙腈中均可稳定存在2个月；孔雀石绿在水溶液中的浓度均呈现测不准状态，可能与其存在形式发生变化有关［1，8，9］；隐色孔雀石绿的测不准可能与其不溶于水有关。在100 ng/mL孔雀石绿乙腈溶液中检测到了隐色孔雀石绿的定性定量离子，见图3C，说明孔雀石绿可能部分转化成了隐色孔雀石绿。为了进一步探究其转化速率与浓度的关系，用乙腈稀释孔雀石绿储备液为1 μg/mL和 100 ng/mL孔雀石绿标准溶液，4 ℃避光保存，上机测试前用乙腈+5 mmol/L乙酸铵（1+1）分别稀释成10 ng/mL的溶液，按照1.3.2条件测定转化成隐色孔雀石绿的情况，测定结果如图4 所示。由图4可知，4 ℃乙腈作为溶剂保存时，孔雀石绿浓度越小，转化速率越快。

3 结论

通过上述实验测定孔雀石绿溶液和隐色孔雀石绿溶液的稳定性可知：（1）乙酸铵对孔雀石绿溶液和隐色孔雀石绿溶液的稳定性起关键性作用。（2）隐色孔雀石绿溶液较孔雀石绿溶液稳定。隐色孔雀石绿在乙腈中不论室温还是4 ℃均可稳定存在；孔雀石绿在乙腈中不稳定，4 ℃在其溶液中可检测到隐色孔雀石绿，且浓度越低，转化成隐色孔雀石绿的速度越快。（3）用乙腈配制的孔雀石绿和隐色孔雀石绿标准储备液应严格按照检测标准［6-7］的要求-18 ℃避光保存。

参考文献：

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（收稿日期：2022-09-22）