食品中蜡样芽孢杆菌检验方法验证结果分析

摘要 ［目的］验证国标平板计数法、最大或然数（most probable numbe，MPN）计数法检测食品中蜡样芽孢杆菌的适用性。［方法］参照GB 4789.14—2014《食品安全国家标准 食品微生物学检验 蜡样芽孢杆菌检验》中平板计数法、MPN计数法检测样品中蜡样芽孢杆菌浓度，对比不同方法的检测结果。同时以蜡样芽孢杆菌为阳性对照，蕈状芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌为阴性对照，验证方法的特异性。［结果］该方法具有特异性，能够准确检出蜡样芽孢杆菌的计数，方法精密度和重复性好，回收率在84%～100%。［结论］2种方法均具有适用性和可操作性，均能达到标准方法要求的技术指标水平，检验结果准确可靠。

关键词 食品；蜡样芽孢杆菌；方法验证；平板计数法；MPN计数法

中图分类号 TS207 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2023）09-0184-06

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.09.044

Abstract ［Objective］To verify the applicability of national standard plate counting method and MPN counting method for detecting Bacillus cereus in food.［Method］The concentration of Bacillus cereus in samples was detected by the first method （plate counting method） and the second method （MPN counting method） according to GB 4789.14-2014 "National Standard for Food Safety，Microbiological Test of Food，Test for  cereus"，and the detection results of different methods were compared.At the same time，Bacillus cereus was used as positive control，and Bacillus mycoides，Bacillus thuringiensis and Bacillus megaterium  used as negative control to verify the specificity of the method.［Result］The method had specificity and could accurately detect the count of Bacillus cereus.The method had good precision and repeatability and the recovery rate was 84%-100%.［Conclusion］Both methods have applicability and operability，and can meet the technical index level required by the standard method，and the test results are accurate and reliable.

Key words Food;Bacillus cereus;Methods validation;Plate counting method;MPN counting method

作者简介 许涵秋（1986—），女，福建宁德人，工程师，从事食品安全检测研究。

蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）自从1950年被Hauge氏首次报道其能引起食物中毒以来，就一直为人们所广泛关注［1］。蜡样芽孢杆菌是一种好氧、兼性厌氧的杆状革兰氏阳性细菌，属于芽孢杆菌科蜡样芽孢杆菌属，能形成热稳定的内生孢子，对环境具有很强的适应性［2-3］。因此，它能够广泛存在于几乎所有种类食品中，在乳制品、婴幼儿食品、粮食、肉制品、海产品、蜂蜜及蔬菜水果等食品中均检出过蜡样芽孢杆菌［4-21］。蜡样芽孢杆菌在水、空气、土壤中也广泛存在［22］，有研究表明，蜡样芽孢杆菌在10～45 ℃、pH 2～11均可生长，最适生长温度为28～35 ℃，pH为4.3～9.3［23］。

2017年，中国疾病预防控制中心卫生应急中心发布的食物中毒事件数据显示，由蜡样芽孢杆菌引起的食物中毒事件分别占食物中毒事件总数和中毒总人数的1.72%和3.63%，仅次于细菌性食物中毒、沙门氏菌、副溶血性弧菌和金黄色葡萄球菌肠毒素，位列第五［24-25］。

2014—2016年，山西省共采集11类食品7 822份样品进行食源性致病菌检测分析，蜡样芽孢杆菌检出率最高，为11.0%［26］。2015—2020年，江西省丰城市采集辖区内各类食品604份样品进行检测分析，结果检出12株蜡样芽孢杆菌，检出率为1.99%［27］。2018年，吉林省共采集8个辖区内各类外卖食品830份样品进行检测分析，结果检出40株蜡样芽孢杆菌，检出率为4.82%［28］。2011—2015年，吉林省共采集9个辖区内流通环节食品1 693份样品进行检测分析，结果检出557株蜡样芽孢杆菌，检出率为32.90%，其中乳与乳制品的蜡样芽孢杆菌污染最为严重，检出率为39.45%；其次为餐饮食品和婴幼儿配方食品，检出率分别为31.49%和31.09%［29］。2020年，武汉市共采集各类食品200份样品进行检测分析，结果检出36株蜡样芽孢杆菌，检出率18.00%，为最高［30］。产毒素蜡样芽孢杆菌按照食物中毒症状分为呕吐型和腹泻型2种，其分泌的毒素耐高温、耐高压，在食品加工过程中不能被分解，人们误食被其污染的食品会引起呕吐或者腹泻，可以导致各种局部或全身性感染，如坏死性肠炎、肝功能衰竭、菌血癥和脑膜炎［31-33］，甚至导致死亡［34］。由此可见，快速、准确地检测蜡样芽孢杆菌是控制食品污染和感染后治疗的关键环节。

我国现行的GB 31607—2021 《食品安全国家标准 散装即食食品中致病菌限量》首次在食品安全国家标准中规定了以米为主要原料制作的散装即食食品中蜡样芽孢杆菌的限量为10 000 CFU/g（mL），而在其他食品中还没有限量要求，建议国家食品安全标准中增加其他类别食品特别是婴幼儿配方食品、婴幼儿辅助食品的蜡样芽孢杆菌指标，更好地确保人民群众食品安全。蜡样芽孢杆菌的检验方法依据GB 4789.14—2014 《食品安全国家标准 食品微生物学检验 蜡样芽孢杆菌检验》，但该标准中对于蜡样芽孢杆菌检测的部分操作步骤和细节没有详细说明，部分技术参数没有明确规定，这些可能会导致检测的不规范。

在使用标准方法进行检测之前，实验室需证实能够正确运用标准方法以验证其技术能力是否达到了标准的规定要求［35］。该研究通过将蜡样芽孢杆菌和蕈状芽孢杆菌接种于脑心浸出液肉汤（BHI）制备成菌悬液，加标于样品中，按GB 4789.14—2014中平板计数法和MPN计数法的检验步骤进行检验计数，并在重复条件下对2种定量方法进行比较研究，验证方法的重复性、加标回收率；同时以蜡样芽孢杆菌为阳性对照，蕈状芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌为阴性对照，验证方法的特异性，为完善蜡样芽孢杆菌定量检测提供理论依据，也为制定相关技术验收标准提供基础试验支撑。

1 材料与方法

1.1 试材与试剂 蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）［CMCC（B） 63303，广东环凯微生物科技有限公司］；蕈状芽孢杆菌（Bacillus mycoides）［CICC 21473，中国工业微生物菌种保藏管理中心］；苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）［CICC 22945，中国工业微生物菌种保藏管理中心］；巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）［CGMCC 1.0217，广东微生物菌种保藏管理中心］。

脑心浸出液肉汤（BHI）、甘露醇卵黄多黏菌素（MYP）琼脂、多黏菌素B、胰酪胨大豆多黏菌素肉汤（TSB）、营养琼脂、50%卵黄乳液、胰酪胨大豆羊血（TSSB）琼脂、硫酸锰营养琼脂、酪蛋白琼脂、蜡样芽孢杆菌生化鉴定试剂盒、革兰氏染色液、动力-硝酸盐培养基（A法）、磷酸盐缓冲液（PBS）均购自广东环凯微生物科技有限公司；米糕（农贸市场小作坊）。

1.2 仪器与设备

SM 530自动高压蒸汽灭菌器（重庆雅马拓科技有限公司）；AC2-6S1生物安全柜（新加坡 ESCO科技有限公司）；SPX-250-Ⅱ 生化培养箱（上海跃进医疗器械有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 菌种活化。

将蜡样芽孢杆菌、蕈状芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌标准菌株从-80 ℃冰箱中取出，划线接种至营养琼脂斜面活化，于36 ℃培养18～24 h。连续转接2代，保证菌种的活性。

1.3.2 混合标准菌液的制备。

用1 μL无菌接种环各勾取一环蜡样芽孢杆菌和蕈状芽孢杆菌于10 mL BHI培养基，36 ℃培养24 h。

1.3.3 样品和加标样稀释液的制备。

称取25 g米糕于无菌均质袋中，加入225 mL PBS，制成10倍样品稀释液，重复2次。同时称取24 g米糕于无菌均质袋中，吸取1 mL混合标准菌液加入其中，加入225 mL PBS，制成10倍加标样稀释液。

1.3.4 样品的稀释与接种（平板计数法）。

吸取“1.3.3”中1∶10的样品和加标样稀释液置于9.0 mL无菌PBS稀释液中，充分混匀制成1∶100的样品匀液，每递增稀释一次，即换用1次1 mL灭菌吸管。根据对样品浓度的估计，选择2～3个适宜稀释度的样品匀液，在进行10倍递增稀释时，分别吸取0.3、0.3、0.4 mL稀释液于MYP琼脂平皿内，用L型涂布棒涂抹均匀。分别吸取0.3、0.3、0.4 mL空白稀释液加入3个MYP琼脂平皿内作空白对照。静置10 min，待样液吸收后，将平板翻转，（30±1） ℃培养24 h，培养后计数平板上的所有菌落数。

1.3.5 样品的稀释与接种（MPN计数法）。

吸取“1.3.3”中1∶10的样品和加标样稀释液置于9.0 mL无菌PBS稀释液中，充分混匀制成1∶100的样品匀液，每递增稀释一次，即换用1次1 mL灭菌吸管。根据对样品浓度的估计，取3个适宜连续稀释度的样品匀液，接种于10 mL TSB中，每一稀释度接种3管，每管接种1 mL于（30±1）℃培养48 h。用1 μL无菌接种环从各管中分别移取1环，划线接种到MYP琼脂平板上，（30±1） ℃培养24 h。

1.3.6 菌种确定和鉴定。参照GB 4789.14—2014进行革兰氏染色镜检、生化鉴定盒生化分型鉴定。挑取纯培养的单个菌落于高倍（16×100）显微镜下进行革兰氏染色镜检。挑取纯培养的单个菌落，按GB 4789.14—2014中步骤进行过氧化氢酶试验、动力试验、硝酸盐还原试验、酪蛋白分解试验、溶菌酶耐性试验、V-P试验、葡萄糖利用（厌氧）试验、根状生长试验、溶血试验、蛋白质毒素结晶试验等生化分型鉴定试验。

2 结果与分析

2.1 2种方法的计数结果

按照“1.3”的试验方法，进行培养、验证和计数，结果如表1～2所示。经过计数，混合标准菌液中蜡样芽孢杆菌的平均含量为4.7×106 CFU/mL，折算为25 g加标样中蜡样芽孢杆菌的含量为1.9×105 CFU/g。

2.2 2种方法的实际样本加标试验检测结果比较

根据表1～2结果，25 g加标样中蜡样芽孢杆菌的含量为1.9×105 CFU/g，回收率以平均值除以1.9×105乘以100计算，得平板计数法的回收率為84.2%、MPN计数法的回收率为100%。结果如表3所示，结果表明2种方法均能较好地计数食品中蜡样芽孢杆菌的数量。

对试验结果采用统计假设检验方法分析，运用F检验法进行等精度测量判定，T检验法进行数据一致性判定，判定结果如表4所示。计算步骤如下：

（1）统计量F（f1，f2）=S12S22，式中，S1为两组对比数据的大值标准偏差；S2为两组对比数据的小值标准偏差；自由度f1=n1-1，f2=n2-1；次数n1=n2=3。经计算，F（f1，f2）=1.00;取显著水平α=0.05，查F分布临界值表得概率p=0.95水平下F0.95（2，2）=19.00，可得F（f1，f2）＜F0.95（2，2），可判断两组对比数据属于等精度测量。

（2）统计量T=1-2Spn1n2n1+n2，SP=（n1-1）S12+（n2-1）S22n1+n2-2，式中，1、2为两组对比数据平均值；S1、S2为两组对比数据标准偏差；Sp为两组对比数据合并标准偏差。计算得T=1.061；取显著水平α=0.05，自由度f=n1+n2-2=3+3-2=4，查T分布双侧临界值表得tα，f=t0.05，4=2.776。可得T＜tα，f，可判断两组对比数据结果一致。

结果说明2种方法检测结果波动性相对较小，精密度和重复性较好，有利于结果的准确性与重现性。

2.3 确定和鉴定结果

2.3.1 革兰氏染色镜检。

蜡样芽孢杆菌、蕈状芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌的革兰氏染色镜检结果如图1所示，结果表明4种菌株均为革兰氏阳性芽孢杆菌，大多呈短链排列。其中巨大芽孢杆菌呈单个或短链排列，部分菌镜检结果呈现阴性反应，可能由于其活化效果不佳，菌体死亡或自溶使部分阳性菌呈阴性反应。

2.3.2 MYP琼脂平板上菌落形态。蜡样芽孢杆菌、蕈状芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌在MYP琼脂平板上的培养结果如图2所示，结果表明，蜡样芽孢杆菌的典型菌落为粉红色，表示不发酵甘露醇，周围有白色沉淀环，表示产卵磷脂酶；蕈状芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌的典型菌落为粉红色，其中苏云金芽孢杆菌周围有粉色沉淀环；巨大芽孢杆菌在MYP琼脂平板上生长受抑制，典型菌落为灰白色，培养基红色褪去而显示出淡黄色，表示发酵甘露醇产酸，并且周围无沉淀环，表明该菌株在MYP琼脂平板上不产卵磷脂酶。

2.3.3 营养琼脂平板上菌落形态。

蜡样芽孢杆菌、蕈状芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌的根状生长试验结果如图3所示，结果表明蜡样芽孢杆菌在营养琼脂平板上呈灰白色，不透明，表面呈融蜡状，边缘呈扩展状，直径4～10 mm，呈粗糙山谷状生长的特征。蕈状芽孢杆菌呈根状生长的特征，苏云金芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌均无上述生长典型特征。

2.3.4 动力试验。

标准菌株动力试验结果如图4所示，结果表明，蜡样芽孢杆菌在动力培养基中沿穿刺线呈扩散生长，巨大芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌沿穿刺线呈弱扩散生长，蕈状芽孢杆菌沿穿刺线呈绒毛状生长。

2.3.5 溶血试验。蜡样芽孢杆菌、蕈状芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌的溶血试验结果如图5所示，结果表明，蜡样芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌在TSSB琼脂平板上产溶血素，有完全溶血环；蕈状芽孢杆菌在TSSB琼脂平板上为弱溶血，巨大芽孢杆菌为不溶血。

2.3.6 酪蛋白分解试验。蜡样芽孢杆菌、蕈状芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌的酪蛋白分解试验结果如图6所示，结果表明，蜡样芽孢杆菌、蕈状芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌菌株在酪蛋白琼脂平板上均呈阳性反应，说明这些菌株均能分解培养基的酪蛋白，使得培养基由绿色变为蓝色，生成的L-酪氨酸在菌落周围形成透明圈；而巨大芽孢杆菌标准菌株在酪蛋白琼脂平板上无上述现象。

2.3.7 蛋白质毒素结晶试验。

蜡样芽孢杆菌、蕈状芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌的酪蛋白分解试验结果如图7所示，结果表明4种菌株均有产生游离芽孢（浅红色），其中仅苏云金芽孢杆菌有产生菱形蛋白色结晶體（深红色）。

2.3.8 其他生化特征。

采用生化试剂盒鉴定，结果见表5。结果表明，蜡样芽孢杆菌的生化特征和蕈状芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌十分相似。虽然淀粉和明胶的试验能有效区分蜡样芽孢杆菌与其他芽孢杆菌，但不能仅以这2项的试验结果进行判定归属的菌种。

3 结论与讨论

近年来，国内外食品中的蜡样芽孢杆菌检出率较高，检验机构正确地按照国家标准方法准确检验食品中的蜡样芽孢杆菌显得十分重要。该研究通过对国家标准GB 4789.14—2014中的2种定量方法（平板计数法、MPN计数法）进行比较研究，并在重复条件下对2种方法与实际添加菌数进行对比，结果表明，平板计数法、MPN计数法均能够很好地计数食品中蜡样芽孢杆菌的含量，方法精密度和重复性较好，回收率在84%～100%。

同时，该研究以蜡样芽孢杆菌为阳性对照，蕈状芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌为阴性对照，通过多种形态学观察和生化试验，验证方法的特异性，结果表明，蜡样芽孢杆菌和蕈状芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌在MYP琼脂平板、营养琼脂平板、TSSB琼脂平板上的菌落形态存在不同程度差异，可以据此将它们区分开来，并以其他生化特征反应为辅助手段；其中营养琼脂平板上的根状生长试验能有效鉴别蜡样芽孢杆菌和蕈状芽孢杆菌。苏云金芽孢杆菌与蜡样芽孢杆菌大部分生化试验结果都相似，只有通过蛋白质毒素结晶试验能有效鉴别开。因此，通过MYP琼脂平板分离纯培养后，以根状生长试验和蛋白质毒素结晶试验为关键手段，以形态学观察和生化试验为辅助手段，可以有效鉴别出蜡样芽孢杆菌，大幅降低蜡样芽孢杆菌的结果假阳性率。总之标准方法具有特异性，能够有效鉴别出蜡样芽孢杆菌。

目前，参照国标方法检测食品中蜡样芽孢杆菌的可参考文献较少，对部分操作步骤细节和部分技术参数没有明确规定。如一是国标中未对酪蛋白分解试验中阴阳性反应的试验现象进行说明与解释；二是蛋白质毒素结晶试验，只有当细菌产生大量游离芽孢，毒素结晶体才会释放出来，才有可能通过染色镜检观察到这些结晶体的形态。因此，这个试验的关键是如何让细菌在最短的时间内产生大量的游离芽孢。可按标准将单个可疑菌落接种于硫酸锰营养琼脂平板上，（30±1）℃培养3～4 d。如镜检时未见游离芽孢，可延长培养时间，直至见到大量游离芽孢为止。染色镜检过程中应严格控制甲醇作用时间及染色时间，清洗时要彻底。蛋白质毒素结晶体的形态是多样的，有菱形、圆形等，并且大小不一。

综上所述，国标中的平板计数法和MPN计数法在检测较高浓度的蜡样芽孢杆菌时均具有适用性和可操作性，均能达到标准方法要求的技术指标水平，检验结果准确可靠。但因该试验未对低浓度蜡样芽孢杆菌进行检验，未能验证2种方法在不同蜡样芽孢杆菌含量的食品中适用性，因此还需进一步试验验证。

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