基于网络药理学和分子对接技术探讨四妙勇安汤治疗冠心病的作用机制

玄霄宇,范吉林,潘文超,李昱静,祝昕杰,张世亮

冠状动脉粥样硬化性心脏病简称冠心病,是冠状动脉粥样硬化病变引起血管管腔狭窄或阻塞、心肌缺血、缺氧或坏死。冠心病归属于中医学“胸痹”范畴,常在寒邪、情绪波动、饮食失节及劳累过度等危险因素诱发下发作。流行病学研究显示,冠心病死亡在全部心血管疾病死因的占比由1990年的29%增长到2013年的37%,2013年因冠心病死亡的病人约139.4万例,较1990年增长了90%[1], 冠心病已成为临床心血管系统的多发病,对中老年人的生命健康造成了严重威胁。 冠心病的发生与内皮细胞功能损伤、炎症反应、血小板黏附、血栓形成、血管平滑肌的迁移与增殖等有关[2]。 临床多采用抗血小板药、抗凝药、他汀类及β受体阻滞剂等治疗,但应用时存在心血管风险[3]。

中医药在防治冠心病方面表现出较大优势,有研究显示,中药能有效缓解心绞痛,调节心律失常,改善心力衰竭等[4]。 四妙勇安汤可治疗脱疽之热毒炽盛者,由清代鲍相敖收入《验方新编》并首次称之为“四妙勇安汤”[5],全方清热解毒、活血止痛,于清热解毒之中寓活血养血之法,气血兼顾,恰合病机。有研究表明,四妙勇安汤的作用机制涉及抗炎、保护血管内皮、调控血管新生、抗凝、预防血栓、调控血脂等方面[6]。孙春林[7]将60例病人分为试验组和对照组,试验组采用加味四妙勇安汤,对照组采用通心络胶囊,试验组总有效率高于对照组。有研究使用常规西药合加味四妙勇安汤治疗冠心病,结果显示,其能显著改善病人血脂和超敏C反应蛋白水平[8]。四妙勇安汤临床治疗冠心病疗效较好,但作用机制尚未明确,本研究基于网络药理学和分子对接技术探讨有效成分及作用靶点,探讨其治疗冠心病的作用机制。

1 资料与方法

1.1 四妙勇安汤的活性成分和潜在靶点筛选 利用中药系统药理学技术平台(TCMSP)对金银花、玄参、当归、甘草四味中药进行检索,得到四妙勇安汤的所有活性成分,以口服生物利用度(OB)≥30%、类药性(DL)≥0.18为筛选条件,得到四妙勇安汤的有效活性成分,并运用SwissTargetPrediction和DrugBank数据库预测活性成分对应的靶点,之后将药物的潜在作用靶点录入全球蛋白质资源(UniProt)数据库,将蛋白质名称转化为Gene Symbol,进行基因的标准化处理。应用Cytoscape软件制作四妙勇安汤活性成分-作用靶点网络图,根据度值(Degree值)选择四妙勇安汤治疗冠心病的关键活性成分。

1.2 冠心病发病机制靶点的获取 在GeneCards和在线人类孟德尔遗传(OMIM)数据库获取冠心病的相关靶点。将2个数据库得到的靶标合并去重,得到冠心病有关基因。

1.3 药物-成分-疾病-靶点网络图的构建 将筛选获得的四妙勇安汤药物活性成分与冠心病疾病靶点相映射,获取交集靶点,即四妙勇安汤治疗冠心病的可能作用靶点。在Cytoscape 3.7.2软件中将交集靶点录入,构建“药物-成分-疾病-靶点”网络图,利用“Network Analyzer”功能分析构建的网络,节点代表药物、有效成分、疾病、靶点;边代表药物与成分、成分与冠心病、冠心病与靶点的作用关系。

1.4 药物-疾病靶点蛋白-蛋白互作(PPI)网络构建并筛选核心靶点 将获得的药物和疾病的交集靶点录入到生物分子功能注释系统(STRING)数据库,构建PPI网络图。将得到的文件以“TSV”格式导入Cytoscape 3.7.2软件中,根据Degree值挑选,得到药物作用于疾病的关键靶点。

1.5 基因本体(GO)功能富集分析和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析 将药物-疾病的交集靶点录入到DAVID数据库,物种选择“Homo sapiens”,进行GO和KEGG富集分析,以P<0.05的标准筛选所获数据,选取前10条绘图。分析关键活性成分作用的核心靶点及其所在的通路,利用Cytoscape软件,选取富集最显著的10条通路,将结果进行可视化分析。

1.6 分子对接 以关键成分化合物为配体,并在PubChem数据库获得小分子3D结构。在PDB数据库以分辨率低、有原始配体等条件选择核心蛋白的3D结构。利用PyMOL对蛋白质进行去水等处理,导入AutoDockTools加氢,将活性成分配体和蛋白受体转换成pdbqt格式文件,运行AutoDockTools 将二者进行对接,选择最低结合能作为结果。以结合能≤-20.93 kJ/mol为参考[9], 对结果进行评估。

2 结 果

2.1 四妙勇安汤活性成分的获取 检索TCMSP数据库得到四妙勇安汤活性成分共688个,筛选后获得有效活性成分127个,其中金银花23个、玄参9个、当归2个、甘草93个。去重后得到四妙勇安汤有效成分作用靶点137个。应用Cytoscape软件构建“活性成分-作用靶点”网络图,图中有254个节点、2 774条边,详见图1。菱形代表靶点,圆形代表不同药物的活性成分,V形代表金银花、玄参、当归、甘草,六边形代表不同药物的重复成分;A1为β-谷甾醇,是金银花、玄参、当归的共有成分;B1为豆甾醇,是金银花、当归的共有成分;C1为山柰酚,是金银花、甘草的共有成分;C2为槲皮素,是甘草、金银花的共有成分;D1为谷甾醇,是甘草、玄参的共有成分。说明四妙勇安汤的治疗作用是通过多靶点、多成分实现的,体现了中药发挥作用的复杂性。应用“Network Analyzer”功能对网络进行拓扑分析,取Degree值居前8位的成分作为四妙勇安汤的关键活性成分,详见表1。

图1 四妙勇安汤活性成分-作用靶点网络图

表1 四妙勇安汤关键活性成分

2.2 四妙勇安汤治疗冠心病的潜在作用靶点 检索GeneCards、OMIM数据库获得疾病靶点,去重后获得冠心病疾病靶点5 339个,取交集得到药物和疾病的映射靶点并绘制Venn图,有120个药物与疾病交集靶点,其可能是四妙勇安汤治疗冠心病的潜在靶点。详见图2。

图2 四妙勇安汤-冠心病交集靶点Venn图

2.3 药物-成分-疾病-靶点网络图的构建 将四妙勇安汤的4味中药、有效活性成分、疾病及交集靶点录入Cytoscape 3.7.2软件中,构建“药物-成分-疾病-靶点”网络图,见图3。图中三角形表示金银花、玄参、当归、甘草;菱形代表药物有效活性成分;V形代表冠心病;椭圆形代表疾病与药物的交集靶点。图中包括233个节点,其中药物4个、疾病1个、交集靶点120个、有效活性成分108个。

图3 药物-成分-疾病-靶点网络图

2.4 药物-疾病靶点PPI网络及核心靶点网络图构建 将获得的药物和疾病120个交集靶点Gene symbol录入到STRING数据库,设定物种为“Homo sapiens”,构建药物与疾病之间的PPI网络图,包括120个节点、1 202条边,平均Degree值为20;节点表示蛋白,边表示蛋白与蛋白之间的关系,详见图4。通过STRING数据库得到数据并录入到Cytoscape 3.7.2软件中,以Degree值≥50为条件进行筛选,得到四妙勇安汤治疗冠心病的核心靶点网络图,节点越大,颜色越深,表示蛋白Degree值越大;连线越粗,颜色越深,说明蛋白之间关系越密切。详见图5。其中5个蛋白基因的Degree值较大,推测这5个基因可能是四妙勇安汤治疗冠心病的关键靶点,基本信息见表2。

图4 PPI网络图

图5 核心靶点网络图

表2 四妙勇安汤治疗冠心病的关键靶点

2.5 GO富集分析 将120个药物与疾病的交集靶点录入到DAVID数据库,120个基因共影响了564条生物过程,以P<0.05 为筛选条件,获得427条生物信息,其中生物过程(BP)302条,细胞组分(CC)52条,分子功能(MF)73条。四妙勇安汤治疗冠心病的生物过程涉及对缺氧的反应、一氧化氮生物合成过程的积极调节、细胞外空间、酶结合、类固醇激素受体活性等。详见图6。

图6 GO功能富集分析

2.6 KEGG通路富集分析 KEGG富集分析应用DAVID数据库,设置P<0.05 为过滤条件,发现120个交集靶蛋白基因主要富集在108条通路上,表明四妙勇安汤可能通过108条通路治疗冠心病。四妙勇安汤作用于冠心病的通络涉及TNF信号通路、磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶B(PI3K-Akt)信号通路、缺氧诱导因子-1(HIF-1)信号通路、钙信号通路、环磷酸鸟苷酸-环磷酸鸟苷酸依赖的蛋白激酶(cGMP-PKG)信号通路等。筛选富集程度较高的10条通路进行图像可视化分析,详见图7。应用Cytoscape软件将四妙勇安汤关键成分-关键靶点-通路关系进行可视化,其中内圈的长方形代表关键活性成分,中圈的菱形代表关键靶点,外圈的六边形代表信号通路,详见图8。槲皮素通过作用于靶点TNF、IL6、TP53、JUN、VEGFA调控TNF信号通路、癌症通路、PI3K-Akt信号通路等,说明四妙勇安汤是通过多靶点、多通路共同作用治疗冠心病。

图7 KEGG富集分析

图8 关键活性成分-靶点-通路网络图

2.7 分子对接技术 根据“活性成分-靶点”网络图,得到关键活性成分槲皮素、β-谷甾醇、山柰酚、豆甾醇、7-甲氧基-2-甲基异黄酮、美迪紫檀素、刺芒柄花素、异鼠李素。PPI网络分析显示,TNF、IL6、TP53、JUN、VEGFA可能是四妙勇安汤治疗冠心病的关键靶点。分子对接结果表明：四妙勇安汤的8个关键成分与5个关键蛋白质的结合能均≤-20.93 kJ/mol, 说明各成分及各蛋白的结合能力均较好,详见表3。将对接结果导入PyMOL软件使其可视化,部分结果见图9。

表3 分子对接结合能 单位：kJ/mol

图9 四妙勇安汤部分活性成分与关键靶点的分子对接

3 讨 论

中医学无“冠心病”病名,将其归属于“胸痹”“心痛”范围。中医学认为冠心病病机属本虚标实,本虚为脏腑亏虚,以心气虚最主要,也可见心阴虚,气虚进一步发展为阳虚,标实主要是指瘀血内阻[10]。陈可冀院士提出的“瘀毒致病”理论,认为冠心病病人病机关键在于血瘀,血瘀贯穿于整个病理过程,瘀血蕴结不解,日久可化热生毒,或从化为毒,长久不愈,一旦遇外因触动,瘀毒骤发,蚀肌伤肉,瘀毒搏结,可发生急性心血管事件[11]。有研究表明,兼具活血解毒功效的药物抗炎、稳定斑块作用较单纯活血或解毒的药物较好[12]。四妙勇安汤可清热解毒、活血止痛,全方含有金银花、玄参、当归、甘草4种药物,金银花甘寒,清热解毒,重用为君;玄参清热凉血、滋阴解毒,合君药清热解毒之力更强;当归辛甘温,补血化瘀,合玄参养血生新;甘草解毒和中,用为佐使,临床广泛用于冠心病的治疗,但作用机制尚未明确。

本研究应用网络药理学探讨四妙勇安汤治疗冠心病的作用机制,结果表明,四妙勇安汤的主要活性成分包括槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇等,其中槲皮素和山柰酚存在于金银花、甘草中。 Chekalina等[13]将冠心病病人分为对照组和研究组,对照组口服β受体阻滞剂、他汀类药物、阿司匹林治疗,研究组在对照组基础上加用槲皮素每日120 mg治疗,24 h动态心电图结果显示,槲皮素组ST段压低总时间和发作次数减少,室性期前收缩数量减少。 张福宸等[14]研究表明,槲皮素可增强慢性心力衰竭大鼠心功能,其机制可能是下调TNF-α介导的抑制炎症反应。槲皮素能改善过氧化氢(H2O2)介导的心肌细胞氧化损伤,减少心肌细胞凋亡,通过抗氧化、抗炎作用,保护心血管的结构及功能[15]。 山柰酚的抗炎作用已被证实,可抑制促炎因子产生及mRNA表达,如TNF-α、白细胞介素8(IL-8)等,调节单核细胞到巨噬细胞的分化、炎症介质的产生及巨噬细胞的活化,具有较强的抗炎作用[16]。汤喜兰等[17]研究显示,槲皮素和山柰酚有明显的抗心肌细胞缺氧复氧损伤作用,是心肌缺血再灌注损伤的治疗基础。

根据药物-疾病靶点PPI网络图,四妙勇安汤治疗冠心病的核心靶点主要包括TNF、IL6、TP53、JUN、VEGFA、表皮生长因子受体(EGFR)等,通过靶点相互作用,抗炎稳定斑块。炎性因子可影响动脉粥样硬化斑块稳定性,在预测冠心病危险中有重要的参考意义[18]。 TNF-α是由活化的巨噬细胞分泌,是作用广泛的促炎细胞因子,存在于动脉硬化损伤部位,介导多种作用,引起炎症进展、斑块不稳定性增强及血栓形成[19]。 有研究表明,TNF-α可缩短编码一氧化氮合酶mRNA的半衰期,一氧化氮(NO)可减少血小板聚集、单核细胞黏附、平滑肌细胞增殖,从而影响斑块稳定性[20]。IL6是促炎细胞因子,是判断动脉粥样硬化斑块是否稳定的重要标志物。有研究显示,IL6是一种上游炎症标志物,与稳定型冠心病病人主要不良心血管事件、心血管疾病和全因死亡率、心肌梗死和癌症死亡率独立相关[21]。 IL6是由活化的免疫细胞产生,促进凝血且诱导产生超敏C反应蛋白(hs-CRP),引发急性炎症反应,导致斑块形成,影响斑块稳定性[22],且IL6能刺激基质金属蛋白酶(MMP)升高,分解细胞基质核心物质胶原纤维,纤维帽变薄,动脉斑块不稳定性增加[23]。 因此,IL6增多可影响斑块的稳定。有研究显示,TP53蛋白是转录因子,可调控细胞生长及诱发凋亡,正常状态下,TP53不断降解维持较低水平,细胞损伤时,中断了TP53蛋白的降解,蛋白水平上升以激活并启动对细胞的修复作用,但细胞损伤严重不能完全恢复时,引起细胞凋亡[24],血管平滑肌细胞异常增殖和凋亡与动脉粥样硬化关系密切。李敏华[25]指出TP53可能通过干预动脉粥样斑块形成,参与冠心病的进程。 房间隔缺损是冠心病的常见亚型,Wang等[26]研究分析发现,房间隔缺损的隔膜组织中VEGFA下调,说明其可能影响心房间隔形成、心肌细胞增殖和心肌发育。有研究显示,VEGF水平与颈动脉内中膜厚度(IMT)有关,推测VEGF的产生可能加速动脉粥样硬化的发展[27]。 以上靶蛋白相互作用,可能是四妙勇安汤治疗冠心病的关键机制。

GO生物过程涉及对缺氧的反应、一氧化氮生物合成过程的积极调节、细胞外空间、酶结合、类固醇激素受体活性、对药物的反应、腺苷酸环化酶激活肾上腺素受体信号通路、线粒体、丝氨酸型内肽酶活性等。KEGG通路富集分析结果表明,四妙勇安汤治疗冠心病的靶点主要集中在TNF信号通路、PI3K-Akt信号通路、HIF-1信号通路、钙信号通路等。PI3K-Akt信号通路是人体内重要的调控血管再生、心肌细胞凋亡及代谢的通路[28]。有研究表明,心力衰竭大鼠心脏组织miR-146a表达显著上调,可能通过启动PI3K/Akt信号通路发挥miR-146a促使心肌细胞凋亡的作用[29]。李赛赛等[28]研究显示,PI3K/Akt信号通路参与抑制心肌细胞凋亡,减轻炎症反应,改善心脏代谢,可作为防治心血管疾病的切入点。吴胜男等[30]研究显示,PI3K/Akt信号通路可能在内吗啡肽-1处理后出现的减轻心肌缺血再灌注损伤中发挥介导作用。HIF-1信号通路是复方治疗心肌缺血的特征通路,缺氧时HIF-1α过表达导致细胞代谢紊乱,破坏心肌细胞,中药活性成分可抑制糖氧剥夺心肌细胞中HIF-1α蛋白的过表达以抑制HIF-1信号通路,从而保护心肌[31]。 Ca2+处理和信号蛋白在维持心脏功能中作用重要[32]。说明四妙勇安汤通过多通路-多途径参与治疗冠心病。

由分子对接结果可知,四妙勇安汤的关键活性成分和核心蛋白质的结合能均≤-20.93 kJ/mol ,说明四妙勇安汤中的活性化合物与核心蛋白结合能力较强,结合较稳定,验证了本研究的预测结果。

综上所述,四妙勇安汤中的槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇等活性成分通过TNF、IL6、TP53、VEGFA等靶点对TNF、PI3K-Akt、HIF-1等信号通路进行调控以影响机体对缺氧的反应、一氧化氮生物合成过程的积极调节、细胞外空间等过程治疗冠心病。因此,今后的研究应在此基础上进行动物实验验证,进而深入讨论四妙勇安汤治疗冠心病的基础作用机制。