血清微RNA-429、肿瘤坏死因子受体相关因子6与肝癌肝动脉化疗栓塞术灵敏度相关性及槐耳颗粒干预作用研究

崔明新，刘晓刚，程大铭，于敬坤，曲凤智

作者单位：唐山市工人医院肝胆外二科，河北 唐山063000

肝动脉化疗栓塞术（TACE）是不能行根治手术肝癌病人的一种重要疗法，但受肝硬化程度、肝功能状态、肿瘤负荷等因素影响，并非所有病人均能达到理想效果，因此早期预测肝癌TACE 灵敏度，采取一定措施增加灵敏度较差病人治疗反应性，对促进缓解意义重大［1］。微RNA-429（miR-429）与被证实肝癌、胃癌等多种肿瘤有关［2］。根据既往报道，miR-429能通过靶向钙敏感受体∕信号转导及转录活化因子3通路，增强卵巢癌、胰腺癌等肿瘤细胞增殖和化疗耐药性［3-4］。肿瘤坏死因子受体相关因子6（TRAF6）是TOLL 样受体4下游物质，在肝癌细胞体外实验中，沉默TRAF6 可拮抗核因子κB 信号传导，减轻化疗抗性［5］。可见miR-429、TRAF6均与化疗灵敏度有关。槐耳颗粒是肝癌等肿瘤不宜手术者与化疗者辅助用药，具有扶正固本，活血消癥作用，应用于乳腺癌病人，可降低其化疗耐药［6］。基于以上背景，本研究尝试探讨血清miR-429、TRAF6 与肝癌TACE 灵敏度相关性及槐耳颗粒干预作用，旨在为临床早期预测肝癌TACE 灵敏度、治疗肝癌及深入认识其不同治疗反应性机制等提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取2016 年1 月至2021 年1 月唐山市工人医院收治的80 例肝癌病人作为研究对象进行前瞻性研究。纳入标准：①符合肝癌诊断标准［7］，临床分期难以手术治疗或因身体原因不能、不愿手术治疗者；②年龄范围18～80岁；③入组前未接受过外科手术或化疗、免疫治疗、靶向治疗等相关抗癌治疗；④巴塞罗那分期（BCLC）分期为A 期、B期或C期，但门脉主干癌栓的BCLC分期C期病人不入选；⑤Child-Pugh 分级为A 级或B 级；⑥美国东部肿瘤协作组（ECOG）体力状态评分≤2 分；⑦预计生存期≥12 周；⑧中医辨证为正气虚弱、瘀血阻滞型，症见神疲乏力、少气懒言、脘腹疼痛或胀闷、纳谷少馨、大便干结或溏泄，脉涩，舌质紫暗或有瘀斑。排除标准：①心、肾功能严重不全者；②伴血液系统疾病者；③有相关药物过敏史者；④过敏体质者；⑤无法进行正常沟通交流者。剔除标准：①符合纳入标准，入选后退出的；②受试者依从性差，未按规定诊疗进行者。

采用电脑随机数字表法，按照随机、平行、对照原则分为对照组和观察组，各40例。其中观察组女18 例，男22 例；年龄范围35～76 岁，年龄（54.25±9.57）岁；体质量指数范围19～26 kg∕m²，体质量指数（23.76±1.05）kg∕m²；BCLC 分期A 期5 例，B 期14 例，C 期21 例；Child-Pugh 分级为A 级17 例，B 级23 例；ECOG 评分0 分8 例，1 分21 例，2 分11 例；对照组女21 例，男19 例；年龄范围34～75 岁，年龄（52.98±9.33）岁；体质量指数范围19～26 kg∕m²，体质量指数（23.90±0.97）kg∕m²；BCLC 分期A 期7 例，B 期15 例，C 期18 例；Child-Pugh 分级为A 级20 例，B 级20 例；ECOG评分0分10例，1分24例，2分6例。两组性别（χ2=0.45，P=0.502）、年龄（t=0.60，P=0.550）、体质量指 数（t=0.62，P=0.537）、BCLC 分 期（χ2=0.60，P=0.741）、Child-Pugh 分级（χ2=0.45，P=0.501）、ECOG评分（χ2=1.89，P=0.388）均衡可比。本研究获唐山市工人医院伦理委员会审核通过［批号2016-（019）］，病人充分知晓，自愿签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1治疗方法 两组均给予TACE 治疗。对照组术后1 d 起口服甲苯磺酸索拉非尼片（石药集团欧意药业有限公司，批号H20213311，批次20151026），每次0.4 g，2 次∕日，空腹吞服。观察组在对照组基础上，于术前1个月及术后3 d开始口服槐耳颗粒（启东盖天力药业有限公司，批号Z20000109，批次20160104），每次20 g，3 次∕日。术后3个月评估疗效。

1.2.2疗效与治疗灵敏度评估 参考改良实体瘤疗效评价标准1.1［8］，将疗效分为完全缓解（所有靶病灶消失）、部分缓解（以基线直径总和为参照，靶病灶直径总和降低≥30%）、稳定（以研究中直径总和最小值为参照，缩小程度与部分缓解不符合，增大程度不符合疾病进展）、进展（以研究中直径总和的最小值为参照，靶病变直径总和增加≥20%，直径总和绝对增长≥5 mm 或出现≥1 处新病灶），在治疗前后分别行CT 扫描，按照以上标准对疗效进行评价，总有效率取完全缓解、部分缓解、稳定之和；治疗灵敏度评估：完全缓解=敏感，部分缓解=一般，稳定和进展=较差。

1.2.3血清miR-429、TRAF6蛋白检测 于治疗前、术后1 个月、术后3 个月，分别采集空腹外周静脉血5 mL，12 000g离心10 min，分离血清，采用实时荧光聚合酶链反应法检测血清miR-429 水平；采用蛋白质印迹法检测TRAF6蛋白表达。

1.3 观察指标（1）比较两组总有效率。（2）比较两组血清miR-429、TRAF6 蛋白。（3）治疗前后血清miR-429、TRAF6 蛋白变化与灵敏度关系。（4）不同灵敏度病人治疗前后血清miR-429、TRAF6 蛋白变化比较。（5）血清miR-429、TRAF6蛋白术后1个月与治疗前差值预测敏感的价值。（6）分析治疗前血清miR-429与TRAF6蛋白关系。

1.4 统计学方法数据采用SPSS 24.0 分析，计数资料用例（%）表示，χ2检验；计量资料采取Bartlett方差齐性检验与Kolmogorov-Smirnov 正态性检验，均确认具备方差齐性且近似服从正态布，以表示，多组间比较以单因素方差分析，两两比较以LSD-t检验，组间比较行独立样本t检验，组内比较行配对t检验；不同时间点、组别交互作用下血清miR-429、TRAF6 蛋白，采用重复测量资料的方差分析；应用Spearman 分析治疗前后血清miR-429、TRAF6 蛋白变化与灵敏度关系，采用受试者操作特征（ROC）曲线及曲线下面积（AUC）分析血清miR-429、TRAF6 蛋白治疗前后变化预测治疗敏感的价值，Pearson 分析血清miR-429 与TRAF6 蛋白关系。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组疗效比较观察组总有效率为95.00%，高于对照组80.00%（P＜0.05）。见表1。

表1 肝癌80例疗效比较∕例（%）

2.2 两组血清miR-429、TRAF6 蛋白比较术后1个月、术后3 个月两组血清miR-429 较治疗前升高，TRAF6 蛋白较治疗前降低（P＜0.05）；且观察组血清miR-429 高于对照组，TRAF6 蛋白低于对照组（P＜0.05）。见表2。

表2 肝癌80例血清miR-429、TRAF6蛋白比较∕

表2 肝癌80例血清miR-429、TRAF6蛋白比较∕

注：miR-429为微RNA-429，TRAF6为肿瘤坏死因子受体相关因子6，β-actin为β肌动蛋白。

2.3 治疗前后血清miR-429、TRAF6蛋白变化与灵敏度关系观察组血清miR-429、TRAF6 蛋白术后1 个月与治疗前差值、术后3 个月与治疗前差值大于对照组（P＜0.05），见表3；分析血清miR-429、TRAF6 蛋白变化与灵敏度关系，结果显示，血清miR-429（r=0.78、0.76，均P＜0.001）、TRAF6 蛋白（r=0.74、0.72，均P＜0.001）术后1个月与治疗前差值、术后3 个月与治疗前差值与灵敏度呈正相关，见图1（完全缓解=3，部分缓解=2，稳定和进展=1）。

图1 肝癌80例血清微RNA-429（miR-429）肿瘤坏死因子受体相关因子6（TRAF6）蛋白术后与术前差值变化与灵敏度关系：A为血清miR-429术后1个月；B为血清miR-429术后3个月；C为TRAF6蛋白术后1个月；D为TRAF6蛋白术后3个月

表3 肝癌80例治疗前后血清miR-429、TRAF6蛋白变化比较∕

表3 肝癌80例治疗前后血清miR-429、TRAF6蛋白变化比较∕

注：miR-429为微RNA-429，TRAF6为肿瘤坏死因子受体相关因子6，β-actin为β肌动蛋白，差值均指绝对值。

2.4 不同灵敏度病人治疗前后血清miR-429、TRAF6 蛋白变化比较血清miR-429、TRAF6 蛋白术后1 个月与治疗前差值、术后3 个月与治疗前差值：敏感＞一般＞较差，两两比较均差异有统计学意义（P＜0.05）。见表4。

表4 肝癌80例不同灵敏度病人血清miR-429、TRAF6蛋白变化比较∕

表4 肝癌80例不同灵敏度病人血清miR-429、TRAF6蛋白变化比较∕

注：miR-429为微RNA-429，TRAF6为肿瘤坏死因子受体相关因子6，β-actin为β肌动蛋白。①与敏感比较，P＜0.05。②与一般比较，P＜0.05

2.5 血清miR-429、TRAF6 蛋白术后1 个月与治疗前差值预测敏感的ROC以敏感者血清miR-429、TRAF6 蛋白术后1 个月与治疗前差值作为阳性样本，以一般+较差者血清miR-429、TRAF6 蛋白术后1 个月与治疗前差值作为阴性样本，绘制ROC 显示，血清miR-429 术后1 个月与治疗前差值预测敏感 的AUC 及 其95%CI为0.78（0.51，1.00）（P=0.023），TRAF6蛋白术后1个月与治疗前差值预测敏感的AUC及其95%CI为0.74（0.50，0.98）（P=0.044），见图2。

图2 肝癌80例血清微RNA-429（miR-429）、肿瘤坏死因子受体相关因子6（TRAF6）蛋白术后1个月与治疗前差值预测敏感的ROC曲线：2A为血清miR-429；2B为TRAF6蛋白图3 肝癌80例血清微RNA-429（miR-429）与肿瘤坏死因子受体相关因子6（TRAF6）蛋白关系

2.6 治疗前血清miR-429 与TRAF6 蛋白关系治疗前血清miR-429 与TRAF6 蛋白呈负相关（r=-0.70，P＜0.001），见图3。

3 讨论

近年来肝癌中西医结合微创诊疗模式被提出，其立足于中医辨证施治疗的整体治疗优势和肿瘤微创介入局部治疗特点，使BCLC A 期达到与开放性手术相同的根治性效果，使以往开放性手术不能治疗的BCLC B∕C期肝癌亦获得满意效果，将肝癌治疗带入人文诊疗新模式［9］。但中医药种类繁多，选取何种药物能获得预期效果值得探讨。

中医学认为，正气虚弱，邪气乘袭，蕴结于肝，气滞血瘀，形成痞块，乃至肝癌，因此宜治以扶正固本，活血消癥。本研究对肝癌病人应用具有扶正固本，活血消癥功效的槐耳颗粒，结果显示，观察组总有效率高于对照组，提示槐耳颗粒能增强肝癌TACE 疗效，增加病人获益。王海瑞、刘兆玉［10］研究发现，在TACE 基础上联合槐耳颗粒，可提高TACE疗效，延长中位肿瘤进展时间，本研究观点与之一致。槐耳颗粒富含生物碱、蛋白质、多糖蛋白等成分，可抑制肿瘤活性，提高免疫力，抑制肝炎病毒，并能改善肝区疼痛、腹胀、乏力等症状，可见槐耳颗粒不仅对肝癌细胞具有直接抑制作用，还能通过抑制肝炎病毒复制、增强体质等途径，间接发挥抗肿瘤功效。中医扶正祛邪提升机体免疫功能，重塑不宜癌细胞生长的微环境，抑制影像学不可见的微小肿瘤，将中医药微环境调理与肝癌TACE 相结合作为特色，充分发挥TACE 局部治疗与中医药整体治疗优势，所以能增加治疗灵敏度，提高疗效。

miR-429 是微小RNA 家族成员之一，敲低miR-429 可抑制肝癌细胞的侵袭性，使用模拟物上调miR-429表达可加重肝癌进展，提示miR-429与肝癌恶性生物学行为有关，呈现出促癌因子作用［11-12］。本研究显示，血清miR-429 术后1 个月与治疗前差值、术后3个月与治疗前差值与灵敏度呈正相关，治疗后升高幅度越大者，治疗灵敏度越高，有助于预测病人治疗灵敏度。且两组术后1个月、术后3个月血清miR-429较治疗前升高，且观察组血清miR-429高于对照组，提示槐耳颗粒能提高miR-429表达，有助于改善肝癌TACE 灵敏度。结合资料［13］分析，miR-429 过表达能通过靶向双特异性磷酸酶4 抑制JNK信号通路来提高癌细胞对化疗的灵敏度。也有观点［14］认为，miR-429 过表达是通过抑制肿瘤细胞增殖、迁移发挥抑癌作用，从而提高治疗反应性的。

TRAF6 可调控免疫反应、细胞增殖、凋亡等［15］。本研究显示，不同治疗灵敏度病人TRAF6 蛋白表达不同，治疗后降低幅度越大者，治疗灵敏度越高，提示TRAF6蛋白与肝癌TACE灵敏度有关。且两组术后1 个月、术后3 个月TRAF6 蛋白较治疗前降低，观察组低于对照组，提示槐耳颗粒可降低TRAF6 蛋白水平，有助于增加病人治疗灵敏度。谢正元等［16］研究发现，槐耳颗粒能抑制肝癌细胞增殖，促进肝癌细胞凋亡，减少并逆转肝癌细胞对阿霉素的耐药性，提高治疗灵敏度，本研究观点与之相似。治疗前较高的TRAF6 可通过细胞外信号调节激酶通路，抑制肝癌细胞凋亡，增加TACE 治疗的抗性，降低病人治疗灵敏度，治疗后TRAF6 下调则能促进肝癌细胞凋亡，并能阻止核因子-κB 信号通路传导，抑制肝癌细胞转移，从而改善治疗灵敏度［17-18］。

同时本研究还发现，血清miR-429、TRAF6 蛋白术后1 个月与治疗前差值预测敏感的AUC 分别为0.78、0.74，提示两者可作为早期预测肝癌TACE 灵敏度的标志物，为临床精准干预提供客观参考依据。此外治疗前血清miR-429与TRAF6蛋白呈负相关，表明血清miR-429与TRAF6蛋白有关，呈现出负向调节作用。Wang 等［19］报道，上调miR-429 通过核因子-κB 通路靶向TRAF6 来抑制肝癌细胞的迁移，佐证了miR-429 与TRAF6 具有上下游靶向作用关系。可见miR-429∕TRAF6 或可成为改善肝癌TACE灵敏度的一个靶点。

综上所述，血清miR-429、TRAF6 与肝癌TACE灵敏度相关，槐耳颗粒可提高miR-429 表达，降低TRAF6蛋白，增强肝癌TACE灵敏度，提高疗效。