基于抗肝纤维化生物活性及近红外谱效相关的鳖甲质量评价研究

曹梦珍，黄 倩，牛 明，赵 旭*，肖小河*

• 药理与临床 •

基于抗肝纤维化生物活性及近红外谱效相关的鳖甲质量评价研究

曹梦珍1, 2，黄 倩2，牛 明2，赵 旭2*，肖小河1, 2*

1. 成都中医药大学药学院，四川 成都 610032 2. 中国人民解放军总医院 第五医学中心 肝病医学部研究所，北京 100039

从鳖甲临床抗肝纤维化功效出发并结合近红外光谱，探索建立关联抗肝纤维化活性的鳖甲质量生物活性评价方法。建立转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）诱导的LX-2肝纤维化细胞模型，采用qRT-PCR检测鳖甲对I型胶原（type I collagen，）mRNA表达的影响，计算鳖甲对mRNA相对表达量的抑制率；采用Western blotting检测鳖甲对COL1蛋白表达的影响，以评价鳖甲在细胞模型上的抗肝纤维化生物活性。采集并处理不同批次鳖甲药材的近红外光谱数据，通过谱-效相关分析探究鳖甲药材近红外光谱数据与其抗肝纤维化活性的相关性，筛选活性波段，建立鳖甲的效应近红外谱，以效应近红外谱下面积评价鳖甲药材的质量。体外实验表明，与模型组比较，鳖甲水提物（water extract of，WECT）处理组细胞中mRNA与蛋白表达水平显著下调（＜0.05、0.01）；基于谱-效相关分析，共筛选得到＞0.6、＜0.05且波数大于8 cm−1的活性波段3个，分别为5226～5235 cm−1、5943～6071 cm−1与6379～6396 cm−1，以3个活性波段下面积为指标，建立鳖甲药材的效应近红外谱，计算各特征波段下面积和，并分析其与生物活性的相关性，两者相关系数为0.813 53。WECT可抑制LX-2细胞外基质的产生来治疗肝纤维化；效应波谱下面积和（5226～5235 cm−1、5943～6071 cm−1与6379～6396 cm−1）作为鳖甲药材的质量评价系数，用于评价鳖甲药材的质量，可区分不同批次鳖甲药材的抗肝纤维化活性。

鳖甲；肝纤维化；质量评价；生物评价；近红外光谱；谱效相关分析

鳖甲来源于鳖科动物鳖Wiegmann的背甲，始载于《神农本草经》，在我国已有上千年的使用历史，中医认为其具有滋阴潜阳、退热除蒸、软坚散结等功效，临床用于治疗阴虚发热、劳热骨蒸、虚风内动、经闭、癥瘕等症[1-2]。既往系统生物学研究显示，鳖甲提取物具有抗纤维化、抗氧化及抗肿瘤等药理作用[2]。临床研究也证实，以鳖甲为君药组方的鳖甲软肝片、鳖甲化纤方及鳖甲煎丸等复方中药具有显著减缓或逆转肝纤维化的临床疗效[3-7]，可见鳖甲在肝纤维化治疗领域具有广阔前景。但目前，鳖甲的成分物质基础，尤其是其发挥抗肝纤维化作用的药效物质基础研究几乎为空白[3]，同时，由于鳖甲为动物药，传统的基于成分的质量评价方法难以对其进行准确客观地判断，这进一步造成了其质量难以保证等问题。由于中药质量的一致性是保障其临床疗效稳定性的重要因素，因此，有必要开发质量控制手段保障其在临床抗肝纤维化治疗领域发挥更大作用。

近红外光谱技术作为一种新兴的检测技术，已广泛应用于食品、药品等多个行业领域。本课题组前期构建了中药效应近红外谱、整合近红外光谱法以及生物评价2种评价方法，并以大黄配方颗粒为例表明与大黄配方颗粒泻下活性高度相关的5个活性特征波段（4011～4390 cm−1、4859～5461 cm−1、7012～7493 cm−1、10 992～11 312 cm−1以及11 871～12 489 cm−1）能够有效地将不同厂家不同批次的配方颗粒区分开，可实现大黄配方颗粒质量波动的快速、在线检测[8]。另有研究显示，采用近红外光谱技术可快速准确地识别猪皮胶、牛皮胶、驴皮胶3种阿胶产品[9]；采用近红外光谱分析技术建立的干姜中多指标成分含量快速预测方法，可对不同产地干姜进行快速无损的质量评价[10]。以上研究表明近红外光谱分析技术可将不同药材或同一药材的不同批次较好地区分，对于中药材的质量控制具有可观的应用前景。

鳖甲在肝纤维化临床治疗中应用广泛，肝纤维化作为慢性肝脏疾病的结局，其中心环节是肝细胞损伤引起的肝星状细胞（hepatic stellate cells，HSCs）的激活[11]，正常情况下HSCs处于静止状态，产生少量细胞外基质（extracellular matrix，ECM）[12]，而激活的HSCs会产生大量的ECM，从而快速引起胶原化反应[13]。ECM主要由I型胶原（type I collagen，COL1）、IV型胶原等组成，COL1侧向排列形成的大量胶原纤维是肝纤维化的典型特征，也是肝纤维化严重程度评价的主要指标。转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）为肝纤维化模型的活化剂，可使HSC处于高活化状[5]。因此，对于动物药鳖甲的质量控制，采用与临床疗效直接关联的抗肝纤维化生物评价模式，基于谱-效相关建立活性校正的指纹图谱，对于保障鳖甲的质量，拥有良好的应用远景。

本研究以鳖甲为模式药，以“源自临床，证于实验”为研究路径，从鳖甲的临床作用出发，基于TGF-β1诱导的人HSC细胞系LX-2肝纤维化细胞模型，初步探索鳖甲水提物的抗肝纤维化生物活性，为鳖甲的质量控制及鳖甲抗肝纤维化机制研究提供线索；对鳖甲近红外谱信息与抗肝纤维化生物活性进行相关性分析，建立关联活性的质量评价模式，以期克服鳖甲质量控制与生物活性关联不强、代表性不足等问题。

1 材料

1.1 细胞

人肝星状LX-2细胞由解放军总医院第五医学中心肝病医学中心提供。

1.2 药材

鳖甲药材（具体信息见表1）购自北京安国药材市场，经解放军总医院第五医学中心肖小河研究员鉴定为鳖科动物鳖Wiegmann的背甲，且按《中国药典》2020年版要求检查合格。

表1 18批次鳖甲药材样品信息

1.3 药品与试剂

DMEM培养基（批号CM10013）购自北京中科迈晨生物技术有限公司；青霉素-链霉素双抗（批号CC008）、胰酶（批号CC008）购自迈晨科技（北京）有限公司；CCK-8试剂（批号FC0720）、RT Master Mix for qPCR（批号HY-K0510）、SYBR Green qPCR Master Mix（批号HY-K0521）购自Med Chem Express公司；qRT-PCR引物由上海生工生物工程公司合成；RNA快速纯化试剂盒（批号ES-RN001）购自上海奕杉生物科技有限公司；RIPA裂解液（批号C1053）购自北京普利莱基因技术有限公司；BCA法蛋白定量试剂盒（批号C190501）购自北京阳光英锐生物科技有限公司；COL1多克隆抗体（批号72026S）购自美国CST公司；GAPDH多克隆抗体（批号A01020）购自Abbkine公司；HRP标记的山羊抗兔IgG二抗（批号P21118）、HRP标记的山羊抗小鼠IgG二抗（批号P21206）购自北京全式金生物技术股份有限公司。

1.4 仪器

HF100型CO2恒温培养箱（上海力申科学仪器有限公司）；SW-CJ-2F/2FD型超净工作台（苏州净化仪器厂）；IX70型倒置显微镜（日本Olympus公司）；MSA36S型分析天平（德国Sartorius公司）；Milli-Q超纯水制备系统（美国Millipore公司）；KQ-500DE型数控超声波清洗仪（昆山市超声波仪器有限公司）；MPA型傅立叶变换近红外分析仪（德国Bruker公司）；Fresco 21型超低速低温离心机、ABI QuantStudio 6 Flex型荧光定量PCR仪（美国Thermo Fisher Scientific公司）；5200Multi型全自动化学发光成像仪（上海天能科技有限公司）。

2 方法

2.1 样品制备

2.1.1 提取物的制备 称取鳖甲药材，粉粹，过80目筛，料液比1∶20，40 ℃、250 kW超声水提30 min，减压浓缩，冷冻干燥，得鳖甲药材的超声水提物（water extract of，WECT），备用。

2.1.2 供试品溶液的制备 称取上述提取物粉末，按照要求配制成相应浓度，过0.22 μm滤膜，得供试品溶液。

2.2 体外实验

2.2.1 WECT细胞毒性的测定 将LX-2细胞以2×105个/mL均匀接种于96孔板中，100 μL/孔，细胞贴壁后，分别加入生药质量浓度为0、25、50、100、150、200、300 mg/mL的WECT处理1 h，随后加入20 ng/mL TGF-β1共培养24 h，按照CCK-8试剂说明书检测细胞活力。

2.2.2 qRT-PCR验证WECT抗肝纤维化生物活性 将LX-2细胞以2×105个/mL均匀接种于24孔板中，500 μL/孔，细胞贴壁后，分别加入生药质量浓度为40、80、120、160、200、300 mg/mL的WECT处理1 h，随后加入20 ng/mL TGF-β1共培养24 h，收集细胞，按照试剂盒说明书提取总RNA并合成cDNA，进行qRT-PCR分析。引物序列见表2。

表2 引物序列

计算WECT对mRNA相对表达量的抑制率，并计算半数效应浓度（50% effective concentration，EC50）值。随后在EC50对应的生药浓度下，考察不同批次WECT对mRNA相对表达的抑制率，评价鳖甲药材的抗肝纤维化生物活性。

相对表达量抑制率＝(模型组相对表达量－给药组相对表达量)/模型组相对表达量

2.2.3 Western blotting检测WECT抗肝纤维化生物活性 将LX-2细胞以2×105个/mL均匀接种于6孔板中，2 mL/孔，细胞贴壁后，分别加入生药质量浓度为120、160、200、300 mg/mL的WECT处理1 h，随后加入20 ng/mL TGF-β1共培养24 h，收集细胞，使用RIPA裂解液提取细胞总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。蛋白样品经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转至PVDF膜，加入5%脱脂奶粉，室温封闭1 h，TBST洗膜后加入COL1、GAPDH抗抗体，4 ℃孵育过夜，洗膜后，加入二抗，室温孵育1 h，最后用ECL发光液显影。

2.3 近红外光谱数据采集及处理

选取10批（S1～S10）鳖甲药材，用于建立基于效应近红外谱的鳖甲质量评价方法，其余8批（S11～S18）用于验证质量评价方法的科学性。取适量WECT，加入去离子水溶解至生药质量浓度1000 mg/mL，统一装入1 mL液体样品测量管，采集光谱。采样方式：光谱扫描范围12 500～4000 cm−1，分辨率8 cm−1，以去离子水溶液为空白，扫描32次，每个样品重复3次，求平均光谱。为了排除干扰因素造成测量结果的偏倚，利用OPUS7.5软件对近红外光谱数据进行一阶导数预处理，并对经过一阶导数预处理的近红光谱数据进行相似度分析。

2.4 不同批次的鳖甲药材抗肝纤维化生物活性的评价

在40、60、120、160、200、300 mg/mL生药质量浓度下测定WECT对肝纤维化模型细胞中mRNA相对表达量的抑制率，并计算EC50值。检测生药浓度为EC50时，10个批次WECT对TGF-β1诱导的肝纤维化模型细胞中mRNA表达量的抑制率，评价不同批次鳖甲药材的抗肝纤维化生物活性。

2.5 统计学分析

3 结果

3.1 体外实验结果

CCK-8法检测WECT的细胞毒性，结果显示WECT在生药浓度不超过300 mg/mL下处理LX-2细胞24 h无细胞毒性（图1-A）。肝星状细胞的活化与增殖是肝纤维化的关键，本实验构建了TGF-β1诱导的LX-2肝纤维化细胞模型，用于评价WECT的抗肝纤维化生物活性。如图1-B、C所示，与对照组比较，模型组mRNA和蛋白表达水平均显著升高（＜0.01）；与模型组比较，WECT（120、160、200、300 mg/mL）组mRNA表达水平显著降低（＜0.05、0.01），300 mg/mL WECT可显著抑制COL1蛋白的表达（＜0.05）。

A-WECT对LX-2细胞存活率的影响 B-WECT对TGF-β1诱导的LX-2细胞COL1 mRNA表达的影响 C-WECT对TGF-β1诱导的LX-2细胞COL1蛋白表达的影响 与对照组比较：##P＜0.01；与模型组比较：*P＜0.05 **P＜0.01

3.2 近红外光谱数据的预处理与相似度分析

10批鳖甲药材（S1～S10）的近红外光谱数据见图2-A，OPUS7.5软件对近红外光谱数据进行一阶导数预处理见图2-B。对经过一阶导数预处理的近红光谱数据进行相似度分析（表3），结果显示10批鳖甲药材的相似大于0.9，这表明10批鳖甲药材的近红外光谱信息的相似度高，提示单以近红外光谱数据难以实现鳖甲药材的质量评价。

3.3 不同批次的鳖甲药材抗肝纤维化生物活性的评价

在40、60、120、160、200、300 mg/mL生药质量浓度下测定WECT对肝纤维化模型细胞中mRNA相对表达量的抑制率，计算得到EC50值为149.5 mg/mL，结果见图3-A。据此，检测在生药质量浓度为150 mg/mL时10个批次WECT对TGF-β1诱导的肝纤维化模型细胞中mRNA表达量的抑制率，评价不同批次鳖甲药材的抗肝纤维化生物活性，结果见图3-B。

A-10批鳖甲药材的近红外光谱数据 B-经一阶导数处理后的10批鳖甲药材的近红外光谱信息

表3 10批鳖甲药材（S1～S10）的相似度分析

A-WECT对肝纤维化模型细胞中COL1 mRNA相对表达量的EC50 B-10批WECT对COL1 mRNA表达量的抑制率

3.4 鳖甲药材效应近红外谱的建立与应用

对10批鳖甲药材的近红外光谱数据和鳖甲对TGF-β1诱导的肝纤维化模型细胞中mRNA相对表达量的抑制率进行相关性分析，共筛选得到＞0.6、＜0.05，且波数大于8 cm−1的活性波段3个，分别为5226～5235 cm−1、5943～6071 cm−1与6379～6396 cm−1（图4-A、B）。为进一步探究各活性波段与鳖甲药材抗肝纤维化生物活性的相关性，以各活性波段下面积为指标构建鳖甲药材的效应近红外谱（图4-C），结果表明不同鳖甲药材的效应近红外谱之间存在一定的差异性。将各效应波谱下面积和作为鳖甲药材的质量评价系数，用于评价鳖甲药材的质量，结果表明鳖甲药材的抗肝纤维化活性与质量评价系数呈显著正相关（＝0.886 23，图4-D）。

3.5 鳖甲药材效应近红外谱的验证

为进一步验证质量评价方法的科学性，本研究另取8批鳖甲药材（S11～S18），采集其近红外光谱信息并进行一阶导数处理，结果见图5-A。测定其抗纤维化活性，结果见图5-B。计算各特征波段下的面积，建立效应近红外光谱，见图5-C。随后计算各批次药材的质量评价系数（质量评价系数＝SW1＋SW2＋SW3，SW1、SW2、SW3分别表示5226～5235 cm−1、5943～6071 cm−1与6379～6396 cm−13个波段下的面积和），并将各批次药材的质量评价系数与与其抗肝纤维化活性进行相关性分析（图5-D），结果显示两者呈显著正相关（＝0.813 53），这表明基于鳖甲效应近红外谱构建的鳖甲质量评价系数能够较好评价鳖甲抗肝纤维化生物活性。

A-10批WECT近红外光谱信息与其生物活性的相关性分析结果 B-活性波段筛选示意图 C-10批鳖甲药材的效应近红外谱 D-10批鳖甲药材的质量评价系数与生物活性相关性分析结果图，其中质量评价系数＝SW1＋SW2＋SW3，SW1、SW2、SW3分别表示5226～5235 cm−1、5943～6071 cm−1与6379～6396 cm−1 3个波段下的面积和

A-8批验证药材的近红外光谱信息 B-8批验证药材的抗肝纤维化生物活性 C-8批验证药材活性波段下效应近红外谱 D-效应近红外谱与生物活性相关性分析

4 讨论

鳖甲在临床应用广泛，以鳖甲为君药的复方鳖甲软肝片对肝纤维化及早期肝硬化的疗效显著，是我国为数不多的用于治疗肝纤维化的药物[14]。近年来不少学者，基于生物评价建立了反映中药功效与毒性、中药制剂的一致性等的评价方法，但对于以鳖甲为例的药效物质尚不明确的动物药的质量评价研究较少[15]。因此关联生物活性的质量评价方法建立对于鳖甲的开发与利用有着重要意义[16]。据此，本研究以鳖甲为模式药物，结合鳖甲的抗肝纤维化生物活性与鳖甲药材近红外指纹图谱，通过谱-效相关分析，探究鳖甲的活性波段，用于鳖甲的质量评价，以期为动物药质量控制模式的建立与健全提供参考。

首先，本研究在细胞水平证实了鳖甲水提物的抗肝纤维化生物活性，实验表明，WECT可以减少TGF-β1诱导的肝纤维化LX-2细胞模型中mRNA及蛋白的表达，这提示WECT可能通过抑制ECM的沉积而发挥抗肝纤维化生物活性；在此基础上，本研究基于WECT对肝纤维化细胞模型中mRNA表达量的抑制率，建立了鳖甲药材生物活性评价方法；并通过对生物活性与近红外光谱数据进行相关性分析，筛选出具有高相关性的3个活性波段，分别为5226～5235 cm−1、5943～6071 cm−1与6379～6396 cm−1，以此3个活性波段下面积为指标建立了鳖甲抗肝纤维化效应近红外谱，以效应近红外谱下面积和，作为质量评价系数，并应用于鳖甲药材质量评价，结果显示，质量评价系数与抗肝纤维化生物活性呈正相关且相关性良好，这提示基于效应近红外谱建立鳖甲的质量评价系数，在一定程度上能够区别不同鳖甲的抗肝纤维化生物活性。

综上，本研究以鳖甲为例，首先在细胞水平验证了鳖甲的抗肝纤维化生物活性，通过近红外光谱数据的分析与抗肝纤维化活性评价，建立了鳖甲效应近红外谱，并通过计算鳖甲的质量评价系数，实现了对鳖甲功效质量的评价，为鳖甲药材的开发与利用提供了有力保障，从而为鳖甲及动物药质量评价方法的建立或建全提供了新的线索。此外，基于效应近红外谱活性波段的鳖甲质量评价，是关联生物活性、操作相对简便的质量评价方法，可为其他动物药质量评价方法的建立或完善提供一定参考。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

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Quality evaluation ofbased on anti-liver fibrosis biological activity and effect-related near-infrared spectrum

CAO Meng-zhen1, 2, HUANG Qian2, NIU Ming2, ZHAO Xu2, XIAO Xiao-he1, 2

1. College of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 610032, China 2. Department of Hepatology, the Fifth Medical Center of Chinese PLA General Hospital, Beijing 100039, China

To explore the biological activity evaluation method of Biejia () quality related to anti-hepatic fibrosis activity based on its clinical anti-hepatic fibrosis effect and combined with near-infrared spectroscopy.Transforming growth factor-β1 (TGF-β1) induced LX-2 liver fibrosis cell model was established, qRT-PCR was used to detect the effect ofon type I collagen () mRNA expression, the inhibition rate ofmRNA expression was calculated; Western blotting was used to detect the effect ofon COL1 protein expression to evaluate the anti-hepatic fibrosis bioactivity ofon cell model. Near-infrared spectral data of different batches ofwere collected and processed, the correlation between near-infrared spectral data ofand their anti-liver fibrosis activity through spectrum effect correlation analysis was explored, and the active band was screened. The effect-near infrared spectrum ofwas established, and the area under the effect near infrared spectrum was used to evaluate the quality of.experiments showed that compared with model group,mRNA and protein expressions in water extract of(WECT) were significantly decreased (< 0.05, 0.01). Based on spectrum effect correlation analysis, three active bands with> 0.6,< 0.05 and wave number greater than 8 cm−1were screened, which were 5226—5235 cm−1, 5943—6071 cm−1and 6379—6396 cm−1, respectively. Taking the area under the three active wavebands as the index, the effective near-infrared spectrum ofwas established, the area sum under each characteristic waveband was calculated, and its correlation with biological activity was analyzed. The correlation coefficient between the two was= 0.813 53.WECT can inhibit the production of LX-2 extracellular matrix to treat liver fibrosis; The sum of the area under the effect spectrum (5226—5235 cm−1, 5943—6071 cm−1and 6379—6396 cm−1) is used as the quality evaluation coefficient ofto evaluate the quality of, which can distinguish the anti-liver fibrosis activity of different batches ofmedicine.

; liver fibrosis; quality evaluation; biological evaluation; near-infrared spectroscopy; spectrum-effect correlation analysis

R285.5

A

0253 - 2670(2023)10 - 3150 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.10.012

2023-01-16

国家自然科学基金重点项目（81930110）；国家中医药传承创新团队项目（ZYYCXTD-C-202005）

曹梦珍（1997—），女，硕士研究生。E-mail: Caomengzhen1213@163.com

肖小河，主要从事中药鉴定学和临床中药学工作。Tel: (010)66933322 E-mail: pharmacy302xxh@126.com

赵 旭，主要从事天然药物化学研究。E-mail: xuzhao080@outlook.com

[责任编辑 李亚楠]