HPLC一测多评法测定猴耳环消炎颗粒中没食子酸等3个活性成分的含量

王 萍，刘 艳，杭 婧，李 佳，王玉

淮安市食品药品检验所，淮安223300

猴耳环消炎颗粒是由单味药材猴耳环制成的中药制剂。猴耳环主要含有黄酮类、酚酸类等有效成分，如没食子酸、槲皮苷、杨梅苷等[1，2]。其中，没食子酸具有抗菌、抗病毒等作用；槲皮苷具有祛痰、止咳、消炎镇痛等作用[3，4]；杨梅苷具有很强的抗氧化性和消炎、抗菌、镇痛、降血糖、保肝、抗肿瘤等功效[5]。《中国药典》2020 年版规定，采用双波长、混合对照的方法对猴耳环消炎片[6]和猴耳环消炎胶囊[7]中的没食子酸和槲皮苷两种成分进行质量控制。《国家药品标准》新药转正标准第86册[8]中，猴耳环消炎颗粒含量测定项下仅有没食子酸的含量控制指标。现有标准均以没食子酸和槲皮苷双对照品法对猴耳环消炎片[9]及猴耳环消炎胶囊[10]进行质量控制，而对猴耳环消炎颗粒的质量控制尚不完善。鉴于中药成分对照品成本高、检验步骤复杂，本研究选择价廉易得的没食子酸作为内参，建立其与槲皮苷和杨梅苷的相对校正因子（relative correction factor，RCF），采用高效液相色谱一测多评法（HPLC-quantitative analysis of multi-components by single marker，HPLC-QAMS），实现对猴耳环消炎颗粒的多指标质量评价。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters 2695/2998 高效液相色谱仪、Waters X bridge C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）、SunFire C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）[沃特世科技（上海）有限公司]；UltiMate 3000 高效液相色谱仪（赛默飞世尔科技公司）；Agilent 1260 高效液相色谱仪、Agilent Eclipse Plus C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）（安捷伦科技有限公司）；XS-205DU 电子天平、XP-6 电子天平（梅特勒托利多集团）；Milli-Q 型超纯水机（德国默克公司）。

1.2 试剂及药品

没食子酸对照品（批号110831-201906，纯度91.5%）、杨梅苷对照品（批号111860-201703，纯度95.2%）、槲皮苷对照品（批号111538-202007，纯度93.5%）均购自中国食品药品检定研究院；猴耳环消炎颗粒购自江西杏林白马药业公司（批号200108、191260、191192、191169）和广州泰莱制药有限公司（批号2005061、1912321、1912121、2005081、2108021）。

甲醇、乙腈（色谱纯，国药集团化学试剂有限公司），磷酸（色谱纯，阿拉丁试剂有限公司），水为自制超纯水。

2 方法与结果

2.1 溶液制备

混合对照品溶液：取没食子酸、杨梅苷和槲皮苷对照品各适量，分别精密称定，加入50%甲醇溶解并定量稀释制成含没食子酸、杨梅苷和槲皮苷浓度分别为150、2.5、4.0 μg·mL-1的混合对照品储备液。

供试品溶液：取猴耳环消炎颗粒约1.1 g，精密称定，置50 mL 具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，称定重量，超声提取（250 W，100 kHz）20 min，放冷后补足失重，0.45 μm 微孔滤膜过滤，取续滤液，即得供试品溶液。

2.2 色谱条件

Agilent Eclipse Plus C18色谱柱（4.6 mm ×250 mm，5 μm）；流动相A 为乙腈，流动相B 为0.2%磷酸溶液[11，12]，线性梯度洗脱（A:B）：0 min（3:97）→10 min（3:97）→25 min（20:80）→35 min（20:80）→40 min（25:75）→50 min（50:50）→55 min（3:97）→60 min（3:97）；流速0.8 mL·min-1；柱温25℃；检测波长325 nm；进样体积20 μL。典型色谱图见图1。

图1 猴耳环消炎颗粒HPLC 典型色谱图

2.3 方法学验证

2.3.1 线性关系考察 按“2.2”项下色谱条件，精密吸取“2.1”项下混合对照品储备液2、4、8、16、32 μL，进样并记录色谱图，测定各对照品的峰面积。以各成分色谱峰面积（Y）对进样溶液中的系列质量（X，μg）进行线性回归分析。结果表明，没食子酸、杨梅苷和槲皮苷在各自的系列进样质量范围内，与峰面积响应均呈良好线性关系，见表1。

表1 3 种成分的线性回归方程、相关系数及线性范围

2.3.2 校正因子f 的建立及耐用性评价 精密吸取混合对照品溶液5、10、15、20、30 μL，按“2.2”项下色谱条件测定，每个浓度分别进样3 次，取平均值，记录各对照品的色谱峰面积，根据校正因子计算公式：

式中，CA为待测物的浓度；AA为待测物的峰面积；CB为没食子酸的浓度；AB为没食子酸的峰面积。

计算待评价成分杨梅苷、槲皮苷的校正因子fA/B，见表2。

表2 杨梅苷、槲皮苷的校正因子fA/B

2.3.2.1 不同色谱柱对fA/B的影响 取“2.1”项下的混合对照品溶液，分别精密吸取20 μL，以0.8 mL·min-1的流速在Waters 2695/2998 高效液相色谱仪上运行，考察3 种色谱柱对各成分fA/B的影响，均能达到较好的分离效果，杨梅苷、槲皮苷的fA/B的RSD值依次为0.42%、0.48%，表明色谱柱的更换对各成分fA/B无显著影响。

2.3.2.2 不同流速对fA/B的影响 取“2.1”项下的混合对照品溶液，分别精密吸取20 μL，采用Agilent Eclipse Plus C18色谱柱，考察3 种流速在Waters 2695/2998 高效液相色谱仪上的运行，各成分均能达到较好的分离效果，杨梅苷、槲皮苷的fA/B的RSD值依次为0.37%、0.51%。表明流速对各成分fA/B无显著影响。

2.3.2.3 不同仪器对fA/B的影响 取“2.1”项下的混合对照品溶液，分别精密吸取20 μL，采用Agilent Eclipse Plus C18色谱柱，以0.8mL·min-1的流速分别在3 种高效液相色谱仪上检测，各成分均能达到较好的分离效果，杨梅苷、槲皮苷的fA/B的RSD 值依次为0.52%、0.34%，表明不同仪器对各成分fA/B无显著影响。

2.3.2.4 色谱峰定位参数考察 取混合对照品溶液，分别采用3 种色谱柱，在3 种色谱仪上测定并计算待测成分没食子酸、杨梅苷和槲皮苷的相对保留时间值（R），结果见表3。

表3 仪器与色谱柱对猴耳环消炎颗粒中3 个成分相对保留时间的影响

2.3.3 进样精密度试验 精密吸取“2.1”项下混合对照品储备液20 μL，按“2.2”项下条件，连续进样6次。结果显示，测得没食子酸、杨梅苷、槲皮苷峰面积的RSD（n=6）分别为0.20%、0.18%、0.31%。

2.3.4 重复性试验 取批号为200108 的猴耳环消炎颗粒适量，按“2.1”项下方法平行制备供试品溶液6 份，按“2.2”项下条件进行测定。记录3 个化合物峰面积积分值并计算RSD，结果显示没食子酸、杨梅苷、槲皮苷含量的RSD（n=6）分别为0.41%、0.36%、0.26%。

2.3.5 稳定性试验 取批号为200108 的猴耳环消炎颗粒，按“2.1”项下方法制备供试品溶液，室温放置0、8、12、16、20、24 h 后，按“2.2”项下条件进样测定。结果显示没食子酸、杨梅苷、槲皮苷峰面积的RSD（n=6）分别为0.36%、0.27%、0.34%，说明供试品溶液中这3 个成分在室温放置24 h 内稳定性良好。

2.3.6 加样回收率试验 分别精密称取没食子酸、杨梅苷和槲皮苷对照品适量，置50 mL 量瓶中，加50%甲醇溶液定容至刻度，配制成混合对照品溶液（没食子酸3.203 6 mg·mL-1、杨梅苷0.054 7 mg·mL-1、槲皮苷0.103 7 mg·mL-1）。

平行称定9 份样品（批号200108）1.1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分成3 组，每组3 份，每组精密加入混合对照溶液1.0、2.0 和3.0 mL（相当于供试品中待测成分含量的50%、100%、150%），每个浓度平行3 份。按“2.1”项下方法制备供试品溶液，按“2.2”项下条件进样测定，根据公式计算没食子酸、杨梅苷、槲皮苷的加样回收率，结果见表4。

表4 加样回收率实验结果（n=3）

2.4 HPLC-QAMS 法与ESM 法结果比较

取9 批猴耳环消炎颗粒样品溶液适量，进样测定，采用HPLC-QAMS 法与ESM 法分别计算样品中没食子酸、杨梅苷和槲皮苷的含量，结果见表5。2种方法的含量测定结果无明显差异，说明HPLCQAMS 法可用于猴耳环消炎颗粒中3 个成分的含量测定。

表5 9 批猴耳环消炎颗粒中3 种成分的含量测定结果（mg/袋）

3 讨论

3.1 测定波长的选择

本研究通过对比不同波长（270、325、350 nm）下的HPLC 色谱图发现，没食子酸在270 nm 下峰高明显高于另外3 个成分，但在350 nm 下几乎没有吸收，而在325 nm 下检测到各色谱峰分离度及峰形良好，基线平稳，在此波长下通过HPLC-QAMS 法计算出的结果准确性高，线性关系良好，故最终选择325 nm 作为检测波长。

3.2 参比物质和质量控制的选择

猴耳环消炎颗粒具有清热解毒、凉血消肿、止泻的功效，可用于治疗急性咽喉炎、急性扁桃体炎、急性胃肠炎等。其中，作为主要成分的没食子酸，价廉易得，且具有良好的稳定性，而杨梅苷和槲皮苷价格高昂，不易获取，稳定性也不及没食子酸。选择没食子酸作为参比物质，各成分的RCF 稳定，重现性良好，既节约了成本，又提高了检测结果的准确性。

3.3 HPLC-QAMS 法用于猴耳环消炎颗粒质量控制的合理性与意义

本实验以没食子酸为内参物，按照相对保留时间确定槲皮苷和杨梅苷2 个成分色谱峰，建立其RCF，并最终确定了3 个活性成分的含量，完善了猴耳环消炎颗粒的多指标质量评价，有利于保证该产品的质量可控和疗效稳定，同时节约检测时间和成本，对该产品的质量控制具有重要意义，也为其他中成药及中药饮片的质量标准提升提供借鉴和参考。