1株LpsB突变致多黏菌素B耐药鲍曼不动杆菌的全基因测序分析*

杨玮,张思琴,陈福红,李素娟

(杭州市中医院检验科,杭州 310007)

鲍曼不动杆菌是院内感染重要的病原菌之一且其耐药率近年来居高不下,尤其是耐碳青霉烯药物的鲍曼不动杆菌(carbapenem-resistantAcinetobacterbaumannii, CRAB)成为临床处理感染的棘手问题。2021年中国CHINET监测网(http://www.chinets.com/)统计显示CRAB占比高达66.5%,然而15 166株全国CRAB对多黏菌素B的耐药率仅为0.5%。因此,目前在临床抗感染联合治疗中,多黏菌素B常作为抗CRAB的最后防线。然而,多黏菌素单独使用会导致异质性耐药的问题,临床多主张联合用药。实际上鲍曼不动杆菌对多黏菌素异质性耐药率远高于其检出耐药率[1]。本研究利用自一名脑出血术后并发脑脓肿患者分离到的1株国内较为少见的多黏菌素B高水平耐药的鲍曼不动杆菌(polymyxin resistantAcinetobacterbaumannii, PmRAB),进行深入的基因学研究,以便为今后的耐药机理及流行病学的研究积累一定实验数据。

1 材料与方法

1.1研究对象 目标菌株来自杭州市中医院重症医学科脑出血术后并发脑脓肿的患者,该患者脑脊液多次同时分离出菌落大小不一异质性耐药的CRAB。在分离前临床曾有多黏菌素B 5万单位QD鞘内注射抗感染治疗史。住院期间先后使用美罗培南、多黏菌素B、头孢哌酮/舒巴坦、替加环素多种抗菌药物治疗,但后因脑部感染持续加重,放弃治疗出院。本研究挑选多黏菌素B高水平耐药小菌落突变株作为研究对象。

1.2主要仪器和试剂 Vitek质谱仪、Vitek 2 Compact全自动微生物仪(法国生物梅里埃公司)、PCR扩增仪(Bio-Rad公司)、全自动毛细管电泳仪(美国AATI公司)、超声波破碎仪(美国Covaris公司)、Nanopore PromethION测序仪(英国Oxford Nanopore公司)、NovaSeq PE150测序仪(美国Illumina公司);血琼脂平板、M-H平板(郑州贝瑞特公司),细菌全基因组提取试剂盒(广州Magen公司),多黏菌素B、美罗培南、替加环素微量肉汤稀释法药敏条、头孢哌酮/舒巴坦药敏纸片(温州康泰公司)。

1.3细菌鉴定及药敏试验 采用基质辅助激光解吸电离飞行质谱方法在Vitek质谱仪进行菌种鉴定。采用Vitek 2 Compact全自动仪AST-GN16卡型进行药敏试验,多黏菌素B、美罗培南、替加环素药敏试验采用微量肉汤稀释法,头孢哌酮/舒巴坦药敏采用K-B纸片扩散法,质控菌株以大肠埃希菌ATCC 25922为质控菌株。结果判读参照据美国临床和实验室标准协会(Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI)M100标准,头 孢 哌 酮/舒 巴 坦 敏 感 性 判 读 参 照CLSI M100中头孢哌酮方案进行。

1.4全基因组测序及分析 采用SDS或STE的方法,对Z198菌株的基因组DNA进行提取,再利用琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度和完整性,测定合格后样品送杭州广科安德生物科技有限公司进行高通量的测序与信息分析。经DNA片段化、末端补平、3′端加A、连接测序接头、PCR扩增与纯化等完成文库制备,然后采用Nanopore PromethION和Illumina NovaSeq PE150测序平台进行测序。组装使用Unicycler软件采用二代+三代数据进行基因组组装,筛分染色体与质粒序列,并将染色体序列组装成为一个环状基因组。测序结果利用各种数据库进行基因组生物信息分析,如基因岛(IslandPath-DIOMB 0.2)、编码基因(GeneMarkS 4.17)、重复序列(RepeatMasker 4.0.5、TRF 4.07)、非编码RNA(RNAscan-SE 1.3.1)、前噬菌体基因(phiSpy 2.3)分别进行比对分析。此外,重点分析比对多位点序列分型(multilocus sequence typing, MLST)信息、耐药基因(ARDB及CARD数据库)和毒力基因(PHI及VFDB数据库),最后,通过Circos软件进行全基因组组装和注释结果可视化分析。

2 结果

2.1药敏试验结果 仅头孢哌酮/舒巴坦药敏采用K-B纸片扩散法,药敏试验抑菌圈为21 mm,参照CLSI-M100中头孢哌酮标准判断为敏感。其余药物的药敏检测采用E-test条法测定最低抑菌浓度(minimal inhibitory concentration, MIC),结果显示,除了替加环素药物MIC为1 μg/mL外,其他所有药物均呈现显示高度耐药。见表1。

表1 1株多黏菌素耐药的鲍曼不动杆菌的抗菌药物敏感性结果

2.2全基因组测序结果 该菌全基因组测序并组装分析,基因组共有1个环状染色体(4 105 371 bp,39.01%G+C)及一个环状固有质粒(72 256 bp,33.37%G+C),无外来质粒。其中编码基因(3 671 484 bp)占基因组的87.88%。在基因组中发现有9个基因岛和4个前噬菌体。另外在基因功能分析中发现效应子分泌蛋白3个T2SS,1个T4SS。测序结果上传至https://submit.ncbi.nlm.nih.gov基因数据库,经认证生成编号为:SUB12155784,SAMN31277299。

2.3MLST分型结果 经全基因组测序对7对管家基因(cpn60、fusA、gltA、pyrG、recA、rplB、rpoB)进行序列比对分析,经 https://cge.cbs.dtu.dk/services/mlst网站查询,结果为(2-2-2-2-2-2),确定为MLST分型ST2型。

2.4耐药基因测序结果 通过对ARDB(Antibiotic Resistance Genes Database)及CARD(Comprehensive Antibiotic Research Database)数据库均进行比对分析,本株分离菌共携带有34种抗菌药物耐药基因,均位于染色体上。比对分析发现,存在LpsB基因与多黏菌素耐药机制密切相关,再进一步将Z198菌株的LpsB基因编码氨基酸序列比对至参考基因组ATCC 19606(QFQ03949.1)的LpsB基因序列,该序列也是CARD数据库中的LpsB基因参考序列。在Z198菌株基因组中检测到LpsB基因有4个氨基酸突变位点,分别是D146G、G218H、E219S、T331I。该菌同时检测出碳青霉烯类药物耐药的相关基因blaOXA-23、blaOXA-66,其他头孢菌素的耐药基因blaADC-73以及其他类抗菌药物的常见耐药基因及多种药物外排泵,见表2。

表2 1株多黏菌素B耐药的鲍曼不动杆菌的耐药基因检测结果

2.5毒力基因检测结果 使用 Diamond 软件,将目标物种的氨基酸序列与VFDB(Virulence Factors of Pathogenic Bacteria)数据库进行比对,把目标物种的基因和其相对应的毒力因子功能注释信息结合起来,得到注释结果。比对分析结果取ID=95%～100%值,共发现检测出19种主要毒力基因,见表3。

表3 1株多黏菌素耐药的鲍曼不动杆菌的毒力基因检测结果

2.6全基因测序组装结果 针对测序样品的组装基因组序列,结合编码基因的预测结果,使用Circos软件[2]对样品基因组进行展示。在图中同时也展示了非编码RNA和基因功能注释等信息。全基因组图谱分别见于图1(染色体)、图2(质粒)所示。

3 讨论

近年来在我国及欧美等地区在肠杆菌科细菌中陆续发现质粒携带的多黏菌素耐药基因mcr-1、mcr-2新亚型[3-4],由于质粒的水平传播将为抗菌治疗带来巨大威胁,然而mcr尚未在鲍曼不动杆菌中被公开报道。目前关于多黏菌素耐药的机制研究除了膜孔蛋白通透性改变见于OmpW[5]外,主要集中在细胞外膜的脂质A改变上。外膜脂质A被修饰主要通过以下两种机制。一是磷酸乙醇胺(pEtN)修饰脂质A,如PmrCAB成分调节系统通过点突变或者移码突变,二是脂质A编码基因突变,如lpxA、lpxC、lpxD[6-7],少见lpxB。本研究中菌株首先mcr基因通过二代测序及PCR技术测定均未检出,其次三代测序分析跨膜蛋白(TCDB数据库)及功能分析并未检出OmpW改变的高表达。因此,该菌株Z198推测主要由染色体上LpsB基因发生多点突变导致多黏菌素高水平耐药。LpsB基因编码产物为糖基转移酶,该酶参与脂多糖合成,当LpsB基因突变会使多黏菌素药物通透性降低,从而导致多黏菌素耐药。此种耐药机制在国内目前尚少见报道,国外Lean等[8]曾报道LpsB基因序列中H181Y突变,而本研究菌为D146G、G218H、E219S、T331I四点突变,与多黏菌素B高水平耐药关系密切。

注:最外圈是基因组序列位置坐标,由外到内,分别是编码基因、基因功能注释结果(根据实际项目情况,可能包含COG(KOG),KEGG,GO数据库的注释结果信息)、ncRNA、基因组GC含量:以窗口(染色体长度/1 000)bp,步长(染色体长度/1 000)bp来统计GC含量,向内的红色部分表示该区域GC含量低于全基因组平均GC含量,向外的绿色部分与之相反,且峰值越高表示与平均GC含量差值越大、基因组GC skew值:窗口(染色体长度/1 000)bp,步长(染色体长度/1 000)bp,具体算法为G-C/G+C,向内的粉色部分表示该区域G的含量低于C的含量,向外的浅绿色部分与之相反。

注:图片由外到内,分别是COG 功能注释分类基因(箭头顺时针表示正链编码)、基因组序列位置坐标、基因组GC含量:以窗口500 bp,步长20 bp来统计,向内的红色部分表示该区域GC含量低于全基因组平均GC含量,向外的绿色部分与之相反,且峰值越高表示与平均GC含量差值越大、基因组GC skew值:以窗口500 bp,步长20 bp来统计,具体算法为G-C/G+C,向内的粉色部分表示该区域G的含量低于C的含量,向外的浅绿色部分与之相反。

此外,Z198还携带其他耐药基因,如同时产D类碳青霉烯类耐药基因OXA-23、OXA-66,这与国内广州佛山报道相似[9]。越南、土耳其也曾报道多重耐药的鲍曼不动杆菌表达ADC-73基因[10-11]。与此同时,该菌还产生对喹诺酮、氨基糖苷类、磺胺类、大环内酯类、四环素类等多种抗菌药物耐药基因及外排泵等耐药机制。然而,本菌株药敏结果显示即使多黏菌素及碳青霉烯类药物都高水平耐药,头孢哌酮/舒巴坦及替加环素依然保持敏感。

利用MLST分析本Z198菌为ST2型多重耐药的鲍曼不动杆菌,是目前国内外报道最为流行的ST型。据全球数据报道ST2、ST1、ST79、ST25占所有型别的71%[12]。ST2型在中国分布占绝对主导地位。如在浙江温州、黑龙江等地鲍曼不动杆菌主要型为ST2型[13-14],仅广州报告以ST195为最多见[15]。

利用VDBP数据库比对,发现Z198含有多种毒力因子。其中外膜蛋白OmpA是一个关键因素,在细菌侵袭及导致细胞毒性发挥重要作用。包膜、脂多糖、菌毛蛋白、生物膜调控系统在细菌黏附、抗吞噬、生物膜形成、免疫调控发挥一定的生物活性。此外,Z198鉴定出11个基因岛、4个噬菌体,这些基因也可能含有与增强细菌侵袭力及菌体与宿主的相互作用有关。病原菌通过分泌系统TNSS(type N secretion systems,目前Ⅰ型～Ⅶ型)将该类蛋白质分泌至胞外或是宿主细胞中,通过控制免疫应答反应以及细胞衰亡引起病理反应,而其中革兰阴性菌的T3SS通常用来从分子水平研究病原菌、感染机制、毒力作用等,是研究得比较多的分泌系统。本研究对于TNSS系统,通过蛋白质序列功能数据库注释结果中,提取分泌系统相关蛋白进行注释。对于革兰阴性菌,另外采用EffectiveT3软件[16](Version 1.0.1)预测T3SS效应蛋白,结果并未在Z198菌种检测到,但检测到3个T2SS及1个T4SS,这与国外近期报道不完全一致[17]。

多黏菌素耐药鲍曼不动杆菌株在全球出现陆续报道,中国目前耐药率尚低,但仍需要临床及实验室高度重视。对于多重耐药鲍曼不动杆菌引起的感染,临床必须减少单药的给药方案以避免出现诱导性异质性耐药问题。一旦发现耐药菌株,尤其是外膜脂质A改变的耐药机制值得持续关注。