6个高州油茶无性系叶片形态结构及耐热性比较

刘慧斌　朱周俊　赵君茹　卢元贤　吴凯　袁德义

关键词：高州油茶；叶片；解剖结构；耐热性

中图分类号：S794.4 文献标识码：A

高州油茶（Camellia gauchowensis Chang）属山茶科（Theaceae）、山茶属（Camellia）常绿乔木。具有树形高大、寿命长、果实大、单株产量高、出油率高等优点，主要分布在我国广东大部分地区和海南等地区[1-2]。油茶的正常生长发育需要适宜温度和充足的水分，温度过低或者过高都会影响果实生长。近年来全球气候变暖，温度持续升高，当温度高过植物承受的范围，植物就会受害，产量就会降低，因此研究油茶耐热性，选育出耐热性较强的树种相当重要。

目前有关耐热性的研究主要集中在生理生化的水平上，研究高温胁迫条件下的相对电导率、叶绿素含量、丙二醛含量和超氧化物歧化酶（SOD）活性等变化，反映植物的耐热性强弱[3-4]。植物的生理生化指标在短期内环境的变化较为明显，而植物的形态结构是长期特定环境下形成的，也可以作为研究耐热性的参考指标[5]。叶片是植物进行光合作用、呼吸作用和蒸腾的重要器官，叶片表皮是直接与外界接触的组织，对高温变化较为敏感，叶片表皮结构的变化也能反映植物对环境的适应能力，叶片是研究耐热性的主要器官[6]。目前，有关叶片解剖结构与植物耐热性的研究在矾根[3]、洋水仙[4]、珙桐[7]、猕猴桃[8]、杜鹃花[9]、报春[10]等植物上已有报道。而有关对油茶叶片解剖结构与耐热性关系的研究较少，仅陈萍等[11]在海南油茶开展了相关研究。有关高州油茶叶片解剖结构与其耐热性关系的研究未见报道。本研究以6 个高州油茶无性系为试材，观察比较不同高州油茶无性系叶片形态、解剖结构和气孔的相关指标，运用相关性分析和隶属函数法对其耐热性进行综合评价，为高州油茶耐热品种的选育、引种栽培等提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

试验于2020 年9 月在广东省清远市古朕茶油发展有限公司高州油茶资源圃进行，实验材料为6 个高州油茶无性系，编号分别为HM19、HMZ25、HMZ24、A11、A5 和A16。

1.2 方法

1.2.1 叶片形态测量 随机挑选30 片叶片，利用图像扫描仪对所选叶片进行扫描， 采用Image-Pro-plus 软件测量叶片的长度、宽度和叶片面积。

1.2.2 叶片解剖结构测定 采用石蜡切片法进行叶片横切面解剖结构制作：取出经卡诺固定液固定后的叶片，经酒精脱水、二甲苯透明、石蜡包埋制成切片（厚度8 μm）、番红固绿染色、封片，于光学显微镜下观察、拍照。

采用Image-Pro-plus 软件测量其叶片厚度（leaf thickness， LT）、上表皮厚度（upper epidermisthickness， TU）、下表皮厚度（lower epidermisthickness， TL）、栅栏组织厚度（thickness ofpalisade tissue， TP）、海绵组织厚度（thickness of spongy tissue， TS）、主脉厚度（thickness of mainvein， TMV）、木质部厚度（xylem thickness， XT）、韧皮部厚度（phloem thickness， PT）和维管束厚度（vascular bundle thickness， VB）。计算栅海比（palisade tissue-spongy tissue ratio， P/S）、叶片紧实度（tightness of tissue structure， TST）、叶片疏松度（looseness of tissue structure， TSL）及变异系数（coefficient of variation， CV）。其中，栅海比=栅栏组织厚度/海绵组织厚度；叶片组织紧实度=栅栏组织厚度/叶片厚度；叶片结构疏松度=海绵组织厚度/叶片厚度。

1.2.3 气孔观察 采用指甲油印记法制片，在显微镜及其成像系统下观察、拍照[12] 。采用Image-Pro-plus 软件测量气孔密度（stomatal density，SD）和气孔长度（stomatal length， SL）。

1.3 数据处理

使用Microsoft Excel 2010 软件进行原始数据的整理和简单的分析，采用SPSS 25.0 软件对数据进行相关性分析和系统聚类分析。相关指数公式[13-14]为：

2 结果与分析

2.1 叶片形态特征

6个高州油茶无性系的叶长、叶宽、叶面积均存在显著差异（P<0.05，表1）。叶长在6.73～9.16 cm之间，平均为8.17 cm，A11 最长，A5 最短；叶宽在3.40～4.50 cm 之间，平均为3.86 cm，HMZ25叶片最宽，A5 叶片最窄；叶面积变化范围为16.58～26.71 cm2，其中HMZ25 叶面积最大，A5叶面积最小。A5 的叶长、叶宽、叶面积均为最小。

2.2 叶片解剖结构特征

2.2.1 葉表皮和气孔 高州油茶叶片结构由上表皮细胞、栅栏组织、海绵组织和下表皮细胞组成（图1）。油茶叶片为异面叶，上表皮和下表皮均由一层长形、圆形、椭圆形细胞紧密排列组成，且上表皮厚度均大于下表皮。气孔位于下表皮，气孔为椭圆形或者扁圆形（图2）。

6 个高州油茶无性系上表皮最厚为HM19，厚度35.11 μm，下表皮最厚为HM19，厚度21.61 μm；上下表皮最薄为A5，分别为23.13、13.85 μm。油茶气孔分布在下表皮，6 个高州油茶无性系叶片气孔密度在126.75～183.09 个/mm2 范围内，气孔长度为24.61～30.33 μm。气孔密度最大为HMZ25，最小为A16。气孔长度最长为A16，最短为HMZ24（表2）。

2.2.2 叶肉组织结构 6 个高州油茶无性系的栅栏组织和海绵组织形态有明显差异（图1）。其中HMZ24 和A5 的栅栏组织由两层细胞组成，HMZ24 两层栅栏组织长度相近，排列疏松，A5上层栅栏组织要长于下层，上层排列紧密，紧挨海绵组织的下层栅栏组织排列疏松。HM19、HMZ25、A11、A16 只有一层栅栏组织，HM19栅栏层细胞细长且排列较紧密，HMZ25、A11、A16 栅栏层细胞短粗且排列疏松。海绵组织排列疏松，细胞大小和形状明显不同。

高州油茶的叶肉解剖结构存在显著性差异（表3）。6 个高州油茶无性系的栅栏组织厚度在82.43～137.41 μm 范围内，其中最大为HMZ24，最小为HMZ25。海绵组织厚度变化范围在153.63～183.47 μm 之间，厚度最大为HM19，最小为A16。海绵组织厚度均明显高于栅栏组织厚度，栅海比均小于1，在0.49～0.90 之间，最大为A16，最小为HM19。叶片结构紧实度范围在0.27～0.41 之间，最大为A16，最小为HM19。叶片疏松度范围在0.46～0.58 之间，最大为HMZ25，最小为A16。

2.2.3 主脉组织结构 主脉主要由上下两层表皮细胞、排列紧密的厚角组织、半月形辐射状排列的木质部、韧皮部组成（图3）。对6 个高州油茶无性系主脉组织结构进行比较发现，主脉厚度、木质部厚度、韧皮部厚度、维管束厚度均达到显著差异水平（表4）。6 个油茶无性系主脉厚度在566.23～821.28 μm 范围内，最大为A16，最小为HMZ24。维管束厚度在262.12～403.07 μm范围内，最大为A16，最小为A11。

2.3 6 个高州油茶无性系耐热性综合评价

2.3.1 筛选高州油茶耐热性指标 高州油茶的叶片指标在品系间达到显著性差异，选出具有代表性的指标来代表耐热性。首先对6 个高州油茶无性系叶片形态和解剖结构的14 项指标运用SPSS软件进行聚类分析，14 项指标可以分为4 类：第1 类包括叶长、叶宽、叶面积；第2 类包括叶厚、栅栏组织厚度、叶片结构紧实度、栅海比；第3类包括上表皮厚度、下表皮厚度、叶片结构疏松度、海绵组织厚度、气孔密度；第4 类包括主脉厚度和维管束厚度（图4）。运用SPSS 软件对14项指标进行相关性分析，获得相关系数矩阵（表5）。指标间的相关系数反映了各指标间的相关性。根据聚类分析结果和相关矩阵，按照公式（1）计算4 类中各指标的相关指数，然后根据相关指数大小对其进行排序（表6）。4 类指标中的典型指标分别为：第1 类为叶面积；第2 类为栅栏组织厚度；第3 类为海绵组织厚度；第4 类为维管束厚度（表6）。

2.3.2 6 个高州油茶无性系耐热性综合评价 根据表6 筛选出的耐热性密切相关的4 项指标（叶面积、栅栏组织厚度、海绵组织厚、维管束厚度），应用隶属函数法，运用公式（2）、（3），求出平均隶属函数值，对6 个油茶无性系的耐热性进行综合评价。隶属函数值越大，耐热性越强。结果表明6 个高州油茶无性系的平均隶属值在0.125～0.793 之间，其中A16 平均隶属值最高，为0.793，HMZ25 平均隸属度最低，为0.125。6 个油茶无性系耐热性强弱依次为：A16>A5>HMZ24>A11>HMZ19>HM25（表7）。

3 讨论

温室效应导致气候变暖，温度升高会使植物产生热害，直接影响植物的外部形态和植物体内活性酶以及渗透调节物质[15]，植物的光合作用也会受到影响[16]。植物叶片是直接感受外界环境变化最大的器官，对外界环境的变化较为敏感，是植物进化过程中可塑性最大的器官，其结构特征能够在一定程度上体现植物本身对所在环境的适应性变化，长期的高温对植物叶片造成外部形态以及内部结构发生变化[17]。

不同无性系的高州油茶的栅栏组织厚度、维管束厚度、海绵组织和叶面积与耐热性的排序基本一致，油茶耐热性与栅栏组织厚度、维管束厚度呈正相关，与海绵组织厚度和叶面积呈负相关。栅栏组织厚度大小顺序为： A16>A5>A11>HMZ25，海绵组织厚度大小顺序为：HMZ25>A11>A5>A16，栅栏组织厚度较大，海绵组织厚度较小，耐热性较强，与前人结果[7， 9， 18]相似，栅栏组织可以增强植株在光合作用中对水分和光能的利用效率，减少叶表面水分蒸发[19]。海绵组织厚度主要反映植物对弱光环境或中生、湿生环境的适应，这些环境往往温度较低、植株耐热性较弱[20]。在植物感受到外界高温胁迫时，为了适应环境而增加栅栏组织厚度，减少海绵组织厚度，使海绵组织细胞结构变疏松。叶脉维管束是植物叶片主要的输导组织，为叶片提供无机养分和水分，并往地下部分输送光合产物，并具有保水、贮水功能各器官[21-22]。叶脉维管束组织厚度越大，养分和水分的利用效率越高，植物体的生命力越旺盛，其抗逆性越强[23-24]。主脉厚度和维管束厚度能增强植物的耐热性，本研究中维管束厚度大小顺序为：A16>A5>HM19>HMZ25，与耐热性顺序基本一致。叶片面积最大为HMZ25，耐热性较差，叶面积最小为A5，耐热性较强，表明叶片的面积大小与耐热性呈负相关性[25]。在6 个高州油茶无性系中，耐热性最强的A16 维管束厚度最大，海绵组织厚度最小，耐热性最差的HMZ25 栅栏组织厚度最小，叶面积最大，A5 叶面积最小，HM19海绵组织厚度最大，维管束厚度最小为A11。

单一指标不能准确评定耐热性，平均隶属函数法通过整合平均具有代表性的耐热性指标来综合评价，减少单方面指标带来的误差，是一种常用的综合性评价方法[26-28]。本研究通过系统聚类、相关性分析与隶属函数分析法，将14 项指标分为4 类，再从4 类中通过相关指数，选出典型的耐热性指标，通过隶属函数法进行综合性评定。叶片的4 项叶片解剖结构指标（叶面积、栅栏组织厚度、海绵组织厚度、维管束厚度）可以作为高州油茶的耐热性的评定指标，研究结果表明：6个高州油茶无性系耐热性顺序为： A16>A5>HMZ24>A11>HMZ19>HM25。