李梦雪,孙国东,李玉姗,刘晓东,霍金海,王伟明
(黑龙江省中医药科学院·黑龙江 哈尔滨 150036)
密蒙花为马钱科植物密蒙花BuddlejaofficinalisMaxim.的干燥花蕾和花序[1]343,是传统的眼科用药。药用始见于《开宝本草》,谓其“主青盲肤翳,赤涩多眵泪,消目中赤脉,小儿麸痘及疳气攻眼”。密蒙花主要分布于我国陕西、甘肃、云南、贵州以及华中和华南等地区。现代研究发现密蒙花具有抑菌抗炎、抗氧化、醛糖还原酶抑制等多种药理活性[2]。降香是豆科植物降香檀DalbergiaodoriferaT.Chen的树干以及根的干燥心材[1]240。药用始载于唐末李珣的《海药本草》[3]。主要分布在海南、两广及福建等地区。现代药理学研究发现其具有扩血管、调血脂、降血压、抗血栓、镇痛、抗炎、抗氧化等作用[4-5]。
研究表明密蒙花中含有黄酮类化合物、苯乙醇苷类、萜类、挥发油等多种化学成分。主要以黄酮和苯乙醇类为主要代表[6]。目前已从密蒙花中分离得到以蒙花苷为代表的28种黄酮类化合物以及35种苯乙醇苷类化合物,如毛蕊花糖苷、红景天苷、松果菊苷、地黄苷、紫丁香苷等[6-7];贺银菊[8]从其花蕾中挥发油中共鉴定出 26 个成分,其中酯类成分含量最高,其次是醇、酮等成分。研究表明降香化学成为极为复杂,主要包含挥发油类、倍半萜类、黄酮类、桂皮酰酚类及其他成分[9];其中黄酮类化合物已鉴别出122种,集中于黄酮类、二氢黄酮类、异黄酮类、异黄烷类、二氢异黄酮类、新黄酮类。
本院中药所采用提取纯化后的降香、密蒙花提取物作为自制防晒乳剂的主要防晒成分,运用超高效液相-四级杆串联飞行时间质谱联用技术快速、准确地对中药防晒乳进行成分分析,推断其化学结构,为中药防晒乳药效物质基础、质量控制的研究奠定基础。
中药防晒乳:实验室自制,以密蒙花、降香为原料经提取分离、纯化、冷冻干燥后作为防晒主要成分,经O/W法制备成乳剂。
AB Sciex ExionLC AD超高效液相色谱仪:Sciex,美国;AB SCIEX Triple-TOFTM5600+质谱仪:Sciex,USA;KQ-300DB型数控超声波清洗器:昆山市超声仪器有限公司;BSA224S-CW型电子天平:Sartorius,Germany;FD-1D-80+冷冻干燥机:北京博医康实验仪器有限公司;AB SCIEX Triple-TOFTM5600质谱仪:美国赛克斯公司。
甲醇(分析纯):西陇科学股份有限公司;乙腈(色谱纯):德国Merck公司;甲酸(色谱纯):美国Fisher公司;蒸馏水:广州屈臣氏食品饮料有限公司。
2.1 供试品溶液的制备 称取中药防晒乳0.5 g,精密称定,置具塞刻度离心管中,精密加入3 mL饱和氯化钠溶液,密塞,用力振摇使分散均匀后,加入8 mL乙腈,超声处理(功率300 W,频率100 kHz)20 min,于4 ℃下以10 000 r/min离心10 min,再次精密加入2 mL乙腈,摇匀,吸上清液用0.22 μm微孔滤膜滤过,取续滤液,作为供试品溶液。
2.2 色谱条件 Waters Acquity UPLC BEH C18色谱柱(100 mm×2.1 mm,1.7 μm),AQUITYUPL-CBEH C18VanGuard Pre-Column预柱(100 mm×2.1 mm,1.7 μm),柱温为40 ℃,流动相为0.1%甲酸溶液(A)-0.1%甲酸乙腈(B),梯度洗脱(0~2 min,5%~70%B;2~22 min,70%~100%B,保持1 min;23~23.1 min,100%~5%B,保持2 min),流速为0.3 mL/min,进样量为5 μL。
2.3 质谱条件 采用电喷雾离子源(ESI),离子化模式为电喷雾正、负离子模式,离子喷雾电压ESI+/ESI-为5 500 V/-4 500 V;离子源温度为550 ℃,DP为80/-80 V,CE为35e V/-35e V,CES为15e V。雾化气体为N2,雾化气Gas1为379.2 kPa,雾化辅助气Gas2为379.2 kPa,气帘气Cur Gas为241.3 kPa。TOF MS扫描范围为80~1 500 DA,IDA设置响应值超过100 cps的8个最高峰进行二级质谱扫描,Product Ion扫描范围为50~1 500 DA,开启动态背景扣除(DBS)。数据采集软件为Analyst TF 1.6 software;数据处理软件系统为Peakview 2.0/ masterview 1.0 software。
2.4 数据分析 通过查阅密蒙花、降香国内外相关文献,结合 TCMSP 数据库将中药防晒乳中密蒙花、降香药材化学成分信息进行汇总,包括中文或英文名称、分子式、结构式、相对分子质量、成分类型、CAS号等,形成的一个包含152 种化合物的一级质谱数据库。将采集的正、负离子数据导入Peakview 2.0,进行目标筛查,选择相对分子质量的理论值与实际值误差在1.0×10-5范围内的化合物进行结构推断。推测各色谱峰对应化合物的分子式;使用 Natural Products HR-MS/MS Spectral Library 1.0 Software(USA AB SCIEX)进行目标筛查,该数据中对照品的二级谱图信息与样品中的化合物进行自动匹配,确认推断成分。
3.1 UPLC-Q-TOF/MS分析 经过色谱条件优化,按“2.2”及“2.3”项下条件进行分析,供试品溶液在正、负离子模式下的色谱图均得到了良好的分离效果及离子化效率,其BPC图见图1,化学成分见表1。
表1 基于UPLC-Q-TOF/MS技术分析中药防晒乳的化学成分
图1 中药防晒乳化学成分总离子流图
3.2 化合物的质谱裂解特征分析
3.2.1 黄酮类化合物的分析鉴定 黄酮类化合物是密蒙花和降香中的特征性成分,本研究中共分析鉴别了31个黄酮类化合物。以化合物2(降香成分)为例,根据元素组成分析该化合物分子式为C15H12O4,tR为6.8 min,二级质谱图见图2,ESI+模式下检测到准分子离子为m/z 257[M+H]+,质谱图中存在的丰度最高的137[M+H-C8H8O]+碎片离子为黄酮类成分标志碎片,此碎片提示A环仅存在一个羟基,准分子离子优先脱去羟基产生239[M+H-H2O]+碎片离子,根据137碎片离子的提示,且239碎片离子的丰度较小,因此推断此化合物的另一个羟基位于B环的4’位,此碎片连续脱去羰基及B环产生211[M+H-H2O-CO]+及147[M+H-H2O-CO-C5H4]+碎片离子,最后在脱去一分子羰基后产生119[M+H-H2O-2CO-C5H4]+碎片离子,对照数据库并结合相关文献[10]以及裂解碎片特征判断该化合物可能甘草素,可能的裂解方式见图3。
图2 化合物2的二级质谱图
图3 化合物2可能的裂解路线
化合物8分子式为C16H12O5,二级质谱图见图4。ESI+模式下检测到准分子离子为m/z 285[M+H]+,此碎片丢失15Da产生270碎片,提示结构中存在甲氧基,此碎片继续丢失一分子水及两分子CO中性碎片并发生重排后产生253[M+H-H2O]+、225[M+H-H2O-CO]+及197[M+H-H2O-2CO]+三个碎片离子,而也可以直接丢失C2O产生213碎片离子,而137[M+H-C9H8O2]+碎片离子的存在提示了A环中仅存在一个羟基,对照数据库并结合相关文献以及裂解碎片特征判断该化合物可能为毛蕊异黄酮,可能的裂解方式见图5。
图4 化合物8的二级质谱图
图5 化合物8可能的裂解路线
3.2.2 苯乙醇苷类化合物的分析鉴定 苯乙醇苷类化合物是密蒙花中的另一大特征性成分,在本次研究中共分析鉴别了4个苯乙醇苷类化合物;以化合物45(密蒙花成分)为例,根据元素组成分析该化合物分子式为C29H36O15,tR为4.5 min,二级质谱图见图6,ESI-模式下准分子离子的质荷比为m/z 623[M-H]-,脱掉端基的基团后得到碎片离子m/z 461[M-H-C9H6O3]-及端基中性碎片133[M-H-C21H30O13]-,再脱掉一个糖基得到碎片离子m/z 315[M+H-C9H6O3-C6H10O4]-,此碎片提示此结构为鼠李糖基团的存在,而此碎片继续将端基脱去得到葡萄糖中性碎片179、161及113碎片离子,对照数据库并结合相关文献[11]以及裂解碎片特征判断该化合物可能为毛蕊花糖苷,可能的裂解方式见图7。
图6 化合物45的二级质谱图
图7 化合物45可能的裂解路线
化合物47分子式为C34H44O19,ESI-模式下检测到准分子离子为m/z755[M-H]-,直接丢失C6H10O5产生593[M-H-C6H10O5]-碎片,此碎片继续丢失C5H8O4后得到461[M-H-C6H10O5-C5H8O4]-碎片,也可直接丢失端基的C9H8O3得到429[M-H-C6H10O5-C5H8O4-C9H8O3]-碎片,对照数据库并结合相关文献以及裂解碎片特征判断该化合物可能为连翘酯苷B,可能的裂解方式见图9。
图8 化合物47的二级质谱图
图9 化合物47可能的裂解路线
经过前期试验研究证实降香、密蒙花乙醇提取物在UVB和UVA区具有良好的紫外吸收能力,经过分离纯化后,作为中药防晒乳剂的主要成分,具有良好的防晒作用[12]。
为了进一步从成分上探究防晒乳剂发挥防晒和抗氧化作用的原理。本次研究采用UPLC-Q-TOF/MS联用技术对中药防晒乳剂进行化学成分分析。优化了提取溶剂和提取方式,确定以乙腈作为提取溶剂,超声30 min的条件下获得的化合物最多。共推断出48个化合物,包括31个黄酮类化合物、4个苯乙醇苷类成分、3个萜类成分、2个木脂素类成分、2个醌类成分、2个苯丙素类成分、2个其他化合物。为密蒙花、降香药材的进一步深入研究奠定了一定基础,也为中药防晒乳的质量控制和未知物的定性筛查提供理论参考和技术支持,为化妆品的质量安全提供保障。
本实验建立了中药防晒乳的 UPLC-QTOF-MS /MS 高效快速分析的方法,全面地分析了其包含的化学成分,分离效果更好,检测更全面,利于更多化合物检出。结合 Peakview1.2 软件进行精确相对分子质量筛选分析,通过比较一级精确荷质比结合二级质谱扫描得到具有较高准确率和分辨率的质谱图,获得更多准确的碎片信息;结合质谱裂解规律、化学对照品质谱信息、相关文献资料等,对中药防晒乳中可能存在的功效性成分进行了验证。
本研究获得的化学成分中大多集中于黄酮类成分和苯乙醇苷类成分,黄酮类化合物是在200~400 nm区域内存在两个主要的紫外吸收带,具有较强的紫外吸收能力。本实验获得的芦丁、蒙花苷等黄酮类成分是本研究制得的中药防晒乳剂主要成分,是其具有吸收紫外线的重要物质基础。通过吸收紫外线的光能转化为热能和无害的光放射出来,有效阻止紫外线对皮肤的损伤。
经化学成分鉴定和文献研究证实制备的中药防晒乳剂除具有吸收紫外线的特征,多种成分还具有抗氧化和抗炎作用,可以起到预防光老化和改善皮肤炎症的作用。本研究为中药抗氧化和抗炎成分的检测和具有开发价值活性成分的发现提供了一种新方法。