体外转录 mRNA 药物及其在肿瘤免疫治疗中的应用

谭珍 向莉 江高峰

体外转录（in vitro transcribed，IVT）mRNA通常指的是在体外以DNA为模板转录获得的一种信使RNA（messenger RNA，mRNA）结构上类似于天然mRNA，可在体内细胞中传递遗传信息。Buckstein等［1］于2005年发现，将mRNA直接注射到小鼠肌肉或皮肤中，可以产生特异性抗体反应，这说明IVT mRNA可以在体内被转录成蛋白质，从而诱导免疫反应。同样地，当特定的IVT mRNA药物被注射到人体内时，也可以进入目标细胞并被翻译成特定蛋白质，从而产生治疗效果。随后的多项研究将IVT mRNA作为一种潜在新型药物逐步应用于各种临床前实验，旨在验证IVT mRNA药物的有效性和安全性，以便未来将其应用于人体临床试验。例如肿瘤免疫治疗、传染病与过敏反应疫苗研发、蛋白质替代疗法、再生医学等领域［2-4］。mRNA药物最初的应用领域是在肿瘤治疗领域，随着mRNA技术的不断优化，引发的不良反应得以降低，mRNA逐渐进入了预防性疫苗领域。近年来，mRNA工程技术取得了迅速发展，这为mRNA药物合成、细胞转染及长时间高表达提供了有力的技术支持。目前，mRNA药物受到越来越多的关注，特别是在肿瘤免疫治疗领域，甚至进入了临床开发阶段［5］。本文将回顾mRNA药物的特征以及其在肿瘤免疫治疗领域的相关研究进展。

1 mRNA 药物概况

1.1 mRNA药物的疗法及研究进展 mRNA疗法是一种具有巨大应用前景的新型基因疗法，它可以通过表达功能性蛋白来治疗基因缺陷性疾病或进行组织修复，也可以通过表达抗原、抗体或受体来应用于免疫治疗。目前mRNA药物的应用主要集中在3个方向上：免疫疗法、蛋白质替代疗法和再生医学疗法［6-8］。在免疫疗法中，肿瘤免疫疗法和预防传染病的疫苗是最为成功和成熟的。在肿瘤免疫治疗中，利用体外合成的IVT mRNA分子将编码相关抗原、特异性抗原、抗体或受体的mRNA输送到细胞内。这些mRNA分子在细胞质内翻译成蛋白质，刺激特定的免疫反应，最终实现预防和治疗疾病的目的。作为一个突破性的技术平台，mRNA具有预防和治疗多种疾病的潜力，有可能在一定程度上取代传统药物和疫苗，开辟新的治疗前沿并革新新的治疗方法［9］。

使用IVT mRNA药物的最基本理念是将预先设计好的基因信息传递到患者细胞内，从而预防或治疗特定的疾病。mRNA药物发展迅速，mRNA疫苗商业化的成功推动了核酸药物开发发展的新阶段。目前，全球mRNA药物适应证主要包括遗传病、新冠肺炎和其他传染病，而国内mRNA研究领域以新冠疫苗为主。目前正在研发的mRNA药物可以根据其用途和药物类型分为3大类：预防性疫苗、治疗性疫苗和治疗性药物［10-12］。据统计，全球有56种mRNA药物正在临床开发中，研发主要集中在疫苗，约占84%，而治疗药物约占16%。除了急需上市的RNA新冠肺炎疫苗外，大多数疫苗都处于早期阶段［13］。

1.2 mRNA 药物的制备及递送方式 目前IVT mRNA的制备方法主要有2种，利用环状质粒脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）、聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）产物或合成的双链寡核苷酸作为模板进行体外合成，转录过程由T7、T3或SP6噬菌体RNA聚合酶在核糖核苷三磷酸盐存在下进行［3］。体外转录后，须经过浓缩、沉淀、提取、层析等一系列纯化过程才能得到mRNA。传统的纯化方法，如阴离子交换色谱法和高效液相色谱法，虽然能够去除双链DNA（double-stranded DNA，dsDNA）污染物，降低mRNA的毒性并改善mRNA的翻译能力，但不易扩展，限制了大规模生产［14］。Baiersdorfer等［15］发现一种简单方法，即通过使用纤维素吸附双链RNA污染物来纯化mRNA。这种方法已经广泛应用于mRNA制备，尤其是在mRNA疫苗的制备中。近年来，该方法已经得到了改进和优化，以进一步提高其纯化效率和产量，例如结合其他技术如超声波和离心等，总体而言，该方法已经成为了mRNA药物制备中的一种重要的技术，具有操作简单、纯化效果好、损失小等优点。

递送系统技术对于确保mRNA药物的有效性和安全性至关重要，它在保护RNA结构、提高靶向能力、减少药物递送剂量和减少毒副作用方面发挥着重要作用。改进传递方式可显著改善细胞对mRNA药物的摄取率，同时也可保护药物进入细胞质内不易被分解。目前，mRNA的主要递送方式分3种：物理传送方式、载体递送方式、直接递送方式。然而，这几种方法都仍存在缺点。体外负载DCs费用昂贵，方法复杂，结内注射及电穿孔等难以在人体身上实施。因此，将mRNA药物共调配脂质纳米粒（lipid nanoparticles，LNPs）是目前最成熟的递送方式之一［16］，保护mRNA不受降解的同时促进细胞摄取效率［17-19］。

1.3 mRNA 药物优势 1972年，Friedmann与Robtin首次提出基因治疗概念，随后在一段时间内，DNA治疗的研究大量兴起，相较于DNA，mRNA药物在半衰期短、稳定性、体内传递效率及其固有免疫原性［5，14］等方面存在一些问题，未能受到重视，而这些问题已经逐渐被攻克，近十余年的大量研究证明，与DNA治疗方法相比，mRNA药物已呈现出明显的优势［20-23］：①mRNA药物进入细胞浆后可以立即翻译大量蛋白质，不需要进入细胞核就能发挥作用。而DNA药物则需要进入细胞核才能转录出mRNA，且需要在细胞分裂核膜破裂时发挥作用，然后再运输至细胞浆中表达蛋白质。可见，mRNA药物进入体内后发挥作用所需时间短，效率更高。②mRNA药物不会融入到宿主基因组，不存在插入突变的风险。而病毒DNA则可能通过整合作用导致基因组发生突变。③mRNA药物只是瞬时翻译蛋白质发挥活性，随后会被彻底降解，副作用容易控制。相反，DNA药物残留时间较长。④生产mRNA药物相对简单、经济。因此，mRNA这种特性更适合应用于药物，其药物研究与应用日益受到重视。

2 mRNA疫苗在肿瘤免疫治疗中的应用

在肿瘤免疫治疗中，mRNA疫苗作为一种新型的治疗手段，具有广阔的应用前景。mRNA疫苗通过递送编码肿瘤抗原的mRNA进入机体，刺激机体免疫细胞来攻击肿瘤细胞，从而达到治疗肿瘤的效果。近年来，mRNA疫苗已经在多种肿瘤治疗中展示出了良好的疗效，例如恶性黑色素瘤、结直肠癌、非小细胞肺癌等［24］。同时，mRNA疫苗还可以与其他肿瘤治疗如化疗、放疗等进行联合应用，提高治疗效果。此外，mRNA疫苗具有快速、灵活、高效、低成本等优势［25］，这些特性也使得mRNA疫苗成为一个备受关注的研究领域。

mRNA疫苗被分为两种类型，基于非扩增mRNA的疫苗和自扩增mRNA，它们均能进入宿主细胞的细胞质翻译产生靶向抗原，并诱导特异性免疫应答［20］。非扩增的mRNA 疫苗只包含mRNA的基本结构，其优势在于分子量较小，没有额外的蛋白质，减少了与宿主产生其他免疫刺激的可能性，且容易大规模制造，而最大障碍是细胞内传递［26-27］。由阳离子脂质和聚合物作为载体的mRNA疫苗已经被证明可增强适应性免疫应答［28］。自扩增mRNA（self-amplified mRNA，SAM）衍生于自扩展 a 病毒，不仅包含编码抗原的序，且含有促进RNA封盖和复制的非结构蛋白，可延长持续时间和表达量，但其分子量大，可能限制细胞的内化效率，且与抗原不相关的蛋白质可能诱导其他的宿主反应［29］。研究［5］证明脂质纳米包封的SAM疫苗可引起针对HIV、H7N9等多种传染病的功能性免疫反应。最近的研究表明［30］，脂质或聚合物载体可诱导1型IFN激活，改善整体疫苗免疫应答。此外，编码免疫调节因子的mRNA，如CD40L、CD70、OX40L、GM-CSF等，也可调节免疫系统的激活［3］。事实上，科学家们几十年来一直在研究和使用mRNA疫苗来针对各种疾病，mRNA疫苗并不是一项新的生物技术，而这一技术开发的初衷是为了研发抗癌疫苗。利用mRNA技术开发肿瘤疫苗的优势在于它可以轻松表达20个以上的肿瘤抗原，特别适用于癌症的个体化治疗，即使只有很少的肿瘤组织样本，也可以获取到所有抗原信息，从而制定个性化的肿瘤疫苗。

不同于传统疫苗直接注射抗原蛋白来激发宿主的免疫反应，mRNA疫苗则是通过引入编码特定疾病抗原的mRNA，使得宿主细胞能够自行产生抗原，并进而引发免疫反应［31］。近年，Moderna公司宣布正在开发一种名为mRNA-4359针对癌症的疫苗。这种mRNA疫苗能表达吲哚胺二氧酶和细胞程序性死亡配体-1（programmed cell death ligand-1，PD-L1）两种抗原，目的是刺激效应T细胞，使T细胞靶向定位并杀死表达这些抗原的细胞，包括肿瘤细胞和免疫抑制性的细胞。有研究证明mRNA疫苗上调了效应T细胞上的检查点分子程序性死亡受体-1（programmed death receptor-1，PD-1）及其配体PD-L1在肿瘤细胞和抗原提呈细胞上的表达［32-33］，由于PD-1∕PD-L1检查点通路主要由干扰素r （Interferon Gamma，INF-r）介导，也可由1型IFN反应诱导，这为 mRNA疫苗与PD-1检查点抑制剂治疗相结合提供了可能。越来越多的研究表明，mRNA疫苗与检查点抑制剂结合，所诱发的T细胞反应和抗肿瘤效应明显增强［14，34］。BioNTech公司基于mRNA的个体化新生抗原特异性癌症疫苗（individualized neoantigen-specific immunotherapy，iNeST）autogene cevumeran与PD-L1抗体Atezolizuab和mFOLFIRINOX化疗连用，在接受手术切除治疗胰腺癌患者的1期临床试验中取得了安全性和耐受性研究成果，在临床相关的时间框架内，通过分析每个患者的肿瘤来指导个体化疫苗设计和按需生产iNeST的可行性得到了证实。该试验的初步结果显示了autogene cevumeran良好的安全性及临床获益。

在肿瘤免疫领域，特别是以mRNA为基础的DC疫苗。目前，将mRNA转染到DC中进行过继转移是第一个基于mRNA的治疗性癌症疫苗进入临床试验［35］。尽管在临床试验中，基于DC的mRNA疫苗疗法仍然占大多数mRNA癌症疫苗。有研究将编码抗原的 IVT mRNA区域与双链siRNA组合杂交，称为ChriST mRNA，ChriST mRNA可以同时表达肿瘤抗原和诱导免疫抑制蛋白STAT3基因沉默，以增强抗肿瘤免疫作用，研究结果证明ChrisT mRNA可以促进DC成熟，增强细胞毒性T细胞免疫应答［22］。

此外，mRNA药物可根据个人突变基因检测，构建个性化IVT mRNA疫苗，一项人体实验证明了这种方法治疗晚期黑色素瘤的可行性和安全性，即所有接种疫苗的患者都产生了所选抗原的CD4和CD8 T细胞应答，且有客观的抗肿瘤反应［36］。而且可通过多种方式增强抗肿瘤免疫，增加编码细胞因子或共刺激因子mRNA，提高IVTmRNA的稳定性和翻译效率，以优化树突状细胞对其在体内的转染能力，增强主要组织相容性复合体I类（major histocompatibility complex class I，MHCI）和主要组织相容性复合体II类（major histocompatibility complex class II，MHCII）分子对mRNA编码抗原的呈递能力［37］。IVT mRNA疫苗需要充分的免疫刺激来调节抗原表达，多种研究证明给予额外的佐剂可发挥免疫刺激作用［38-39］，然而，由于IVT mRNA的特性及向细胞内传递过程的影响，已经有几项研究发现IVT mRNA的免疫刺激在人类的作用正在消退［40］。

当前，RNA在疫苗开发中的初步应用仍存在一些局限性。一方面，裸mRNA被细胞外RNA酶快速降解，并且不能被抗原提呈细胞（antigen-presenting cell，APC）有效转化。其次，mRNA具有三联体免疫原性，可以激活下游干扰素相关通路，诱导天然免疫。固有免疫反应通常由宿主免疫系统通过模式识别受体检测外源性基序病原体相关分子模式激活［41］，尽管这种固有的免疫原性可以辅佐来增强免疫反应，但它矛盾地促进了mRNA降解，减少了抗原表达。另一方面，IVT过程中产生的杂质主要是dsRNA，将增强固有免疫的激活，进一步限制mRNA翻译。因此，提高mRNA翻译效率以及克服固有免疫原性还需要进一步探究。

到目前为止，mRNA疫苗已被应用于治疗侵袭性、不易获得性和转移性实体瘤。在大多数临床试验中，mRNA癌症疫苗与检查点调节剂细胞因子进一步结合，以增强抗肿瘤疗效。尽管SAMs由于其固有的自扩增特性是一种有吸引力的基于mRNA的替代疫苗，但癌症应用的临床研究仅限于病毒复制选择性病毒的早期评估。随着癌症免疫治疗的最新进展，特别是新抗原的发现、个性化疫苗的开发和检查点阻断调节器的开发，已经进行了许多改进，以提高mRNA疫苗对抗癌症的可行性［42］。自美国食品和药物管理局批准六种检查点阻断调节剂和两种嵌合抗原受体-T细胞免疫疗法以来，癌症免疫疗法受到了极大关注［43］。除了在癌症疫苗中的这些初步成功尝试以外，目前有四种针对个体特异性的癌症疫苗，分别是肿瘤或免疫细胞疫苗、肽疫苗、病毒载体疫苗和核酸疫苗正在临床试验中被评估与检查点阻断调节剂或细胞因子疗法相结合，在多发性实体瘤或浸润性肿瘤中具有一些有希望的临床反应［44］。

3 展望

mRNA药物的优势越来越明显，制备过程不断优化，传递方式的不断改进，不仅显著增强了mRNA药物的翻译效率，同时避免降低了免疫原性，不引起过度的免疫刺激。以mRNA为基础的疫苗在肿瘤、传染病及过敏性疾病的研究中取得的结果显示出广阔的前景，尤其是在肿瘤免疫治疗领域，mRNA疫苗与检查点抑制剂结合的效果可显著增强抗肿瘤效应。目前已有多项研究将体外转录mRNA注射入实体肿瘤，使其能在肿瘤细胞表达细胞因子，在肿瘤局部形成持久高浓度细胞因子，促进肿瘤-免疫循环的发生，增强机体内在抗肿瘤免疫能力。然而，目前mRNA药物最大的挑战仍在于进一步提高体内传递效率及降低免疫原性，mRNA药物从基础向临床转化仍需不断研究进步。