复方紫草解毒软膏的质量标准研究*

薛彩红，刘 睿，滕 明

（南宁市中医医院，广西 南宁 530001）

复方紫草解毒软膏是南宁市中医医院的特色院内制剂，全方由紫草、黄连、大黄、鸡血藤、白及、珍珠粉、冰片7味中药组成[1]。方中紫草清热凉血，解毒透疹[2]；黄连泻火解毒[3]；白及消肿生肌[4]；大黄凉血止血，活血祛瘀[5]；鸡血藤行血补血[6]；珍珠粉收敛生肌[7]；冰片清热止痛[8]。全方共奏活血解毒、去腐生肌的功效，对临床上常见的疮疡流脓、创面难愈、新肌难生具有良好的治疗作用，在我院皮肤科和外科得到了较为广泛的应用。紫草清热凉血，解毒透疹[9]，始载于《神农本草经》，具有抗炎作用[10]。紫草的有效成分紫草素可通过抑制人体炎症反应、促进细胞增殖及抑制瘢痕的形成，从而对皮肤创伤愈合有明显的疗效[11]。紫草体外对金黄色葡萄球菌、流感病毒、单纯疱疹病毒、多种真菌均有抑制作用[12]。紫草素是从紫草根部提取的一种蒽醌衍生物[9，13]，适用于湿疹、水火烫伤等[14-16]。紫草油已被2020年版《中华人民共和国药典》一部收载，临床上用于治疗烧伤、烫伤等。

为了有效控制复方紫草解毒软膏的质量，本课题组采用薄层色谱（TLC）法对复方紫草解毒软膏中紫草、黄连、大黄、鸡血藤进行鉴别，采用高效液相色谱（HPLC）法测定复方紫草解毒软膏中芒柄花素、左旋紫草素、大黄酸、大黄素、大黄素甲醚的含量，为复方紫草解毒软膏的质量标准提供定性和定量的检测方法，以期为控制与评价复方紫草解毒软膏的质量提供实验依据。

1仪器与试药

1.1 主要仪器 Agilent1260高效液相色谱仪（安捷伦科技有限公司）；ME155DU型电子天平（北京中恒日鑫科技有限公司梅特勒）；PHG-9206A型电热恒温鼓风干燥箱（上海齐欣科学仪器有限公司）；MP511型PH计（上海三信仪表厂）；AR-300Y型密度测试仪（广东宏拓仪器科技有限公司）；Simplicity超纯水系统（密理博中国有限公司）。

1.2 试药与试剂 复方紫草解毒软膏（批号：20210501，20210502，20210503）均由南宁市中医医院制剂室提供；紫草（批号：20210801）、黄连（批号：20211102）、大黄（批号：20210701）、鸡血藤（批号：20201201）、白及（批号：20210902）、珍珠粉（批号：20210501）、冰片（批号：20210901）均购于广西仙茱中药科技有限公司，经南宁市中医医院药学部薛彩红副主任中药师鉴定均为正品；左旋紫草素对照品（批号：110769-200506，含量：98.5%）、芒柄花素对照品（批号：111703-201504，含量：99.2%）、大黄素对照品（批号：110756-201913，含量：97.8%）、大黄酸对照品（批号：110757-201607，含量：98.2%）、大黄素甲醚对照品（批号：110758-202218，含量：97.3%）盐酸小檗碱对照品（批号：110713-202015）均购于中国食品药品检定研究院；硅胶G板（批号：20200912）购于青岛海洋化工厂；甲醇（色谱纯）（批号：208502）购于泸天化（集团）有限责任公司；磷酸（分析纯）（批号：T200110324）购于国药集团化学试剂有限公司；乙腈（色谱纯）（批号：190060）购于赛默飞世尔科技有限公司。

2 方法与结果

2.1 薄层色谱（TLC）鉴别

2.1.1 紫草的薄层色谱（TLC）鉴别 取复方紫草解毒软膏样品10 g，加甲醇60 mL，60 ℃超声处理30 min，滤过，滤液浓缩至2 mL，加硅胶10 g，研匀，装柱，用300 mL甲醇洗脱，洗脱液浓缩至1 mL，作为供试品溶液。取紫草对照药材1 g，加石油醚（60～90 ℃）30 mL，超声25 min，滤纸过滤，滤液浓缩到1 mL，作为紫草对照药材溶液。按照制备供试品溶液的方法，制得缺紫草药材的阴性对照品溶液。按照2020年版《中华人民共和国药典》一部薄层色谱法，吸取供试品溶液和阴性对照品溶液各4 μL、紫草对照药材溶液3 μL，分别点于硅胶G薄层板上，以石油醚（60～90 ℃）-乙醚-甲酸（6∶7∶0.5）为展开剂，展开，取出，自然晾干。结果供试品在与紫草对照药材色谱相应的位置上显相同颜色的斑点，且阴性对照品无干扰。（见图1）

2.1.2 黄连的薄层色谱（TLC）鉴别 取复方紫草解毒软膏样品10 g，加20 g硅胶，混匀，装柱，用300 mL甲醇冲柱洗脱，洗脱液置于蒸发皿内在水浴锅上浓缩到2 mL，作为供试品溶液。取适量的盐酸小檗碱对照品，加甲醇制成质量浓度为每毫升含0.80 mg的溶液，作为盐酸小檗碱对照品溶液。按照制备供试品溶液的方法，制成缺黄连的阴性对照品溶液。按照2020年版《中华人民共和国药典》一部薄层色谱法，吸取供试品溶液和阴性对照溶液各4 μL、盐酸小檗碱对照品溶液3 μL，分别点于硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-异丙醇-甲醇-水（6∶5∶1∶2∶0.5）为展开剂，置氨蒸气饱和的展开缸内展开，小心取出，自然晾干，置紫外光灯（360 nm）下检视。结果供试品在与盐酸小檗碱对照品色谱相应的位置上显相同颜色的斑点，且阴性对照品无干扰。（见图2）

图1紫草的薄层色谱图

图2 黄连的薄层色谱图

2.1.3 大黄的薄层色谱（TLC）鉴别 取复方紫草解毒软膏样品10 g，加20 g硅胶，研均匀，上柱，用300 mL甲醇冲洗，收集洗脱液蒸干；然后加60 mL纯水12 000 r/min离心10 min，取上清液滤过后加10 mL稀盐酸，超声30 min，再使用乙醚萃取2次，每次40 mL，合并乙醚液，水浴蒸干；加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。另取1g的大黄对照药材，加30mL甲醇，超声30min，过滤，滤液蒸干；残渣加水30 mL使溶解，再加稀盐酸2 mL，回流提取30 min，冷却室温；用乙醚萃取2次，每次30 mL，合并乙醚液，蒸干，残渣加1 mL的三氯甲烷使溶解，作为大黄对照药材溶液。分别取适量的大黄酸、大黄素对照品，分别加甲醇制成质量浓度为每1 mL含大黄酸0.70 mg、大黄素0.80 mg的对照品溶液。按照制备供试品溶液的方法，制备缺大黄的阴性对照品溶液。按照2020年版《中华人民共和国药典》一部薄层色谱法，吸取供试品溶液和阴性对照品溶液各5 μL、大黄酸和大黄素对照品溶液各3 μL、大黄对照药材溶液4 μL，分别点于硅胶G薄层板上，以苯-乙酸乙酯-甲酸（8∶3∶0.5）为展开剂，展开到合适位置，小心取出，自然晾干，置紫外光灯（365 nm）下检视。结果供试品与大黄素对照品、大黄酸对照品和大黄对照药材色谱相应位置上显相同的斑点，且阴性对照品无干扰。（见图3）

图3 大黄的薄层色谱图

2.1.4 鸡血藤的薄层色谱（TLC）鉴别 取复方紫草解毒软膏样品10 g，加甲醇60 mL，水浴加热25 min，边加热边搅拌，趁热滤过，滤液浓缩至2 mL；加入硅胶5 g拌匀，挥干溶剂，置硅胶柱（内径为1.0 cm，干法装柱）上，依次用60 mL石油醚（60～90 ℃）、200 mL三氯甲烷-甲醇（10:1）洗脱，收集三氯甲烷-甲醇（10∶1）洗脱液，水浴蒸干；残渣加三氯甲烷1 mL使溶解，作为供试品溶液。取2 g鸡血藤对照药材，加入60 mL甲醇，超声30 min，然后过滤，滤液水浴蒸干，加2 mL甲醇使残渣溶解，加入3 g硅胶拌匀，挥干溶剂，置硅胶柱（内径为1.0 cm，干法装柱）上，依次用30 mL石油醚（60～90 ℃）、60 mL三氯甲烷-甲醇（10∶1）洗脱，收集三氯甲烷-甲醇（10∶1）洗脱液，水浴蒸干；加1 mL三氯甲烷使残渣溶解，作为鸡血藤对照药材溶液。另取适量的芒柄花素对照品，加甲醇配制成质量浓度为每1 mL含1.00 mg的芒柄花素溶液，作为芒柄花素对照品溶液。按照2020年版《中华人民共和国药典》一部薄层色谱法，吸取供试品溶液和阴性样品溶液各4 μL、芒柄花素对照品溶液3 μL、鸡血藤对照药材溶液3 μL，分别点于硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇（10∶1）为展开剂，展开缸展开，小心取出，自然晾干；置紫外光灯（365 nm）下检视。结果供试品与芒柄花素对照品和鸡血藤对照药材色谱相应位置上显相同颜色的荧光斑点，且阴性对照品无干扰。（见图4）

图4 鸡血藤的薄层色谱图

2.2 含量测定

2.2.1 色谱条件 色谱柱为GeminiR-C18110Å（4.6mm×250mm，5 μm），流动相为乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脱，洗脱程序见表1，流速为1 mL/min，柱温为30 ℃，芒柄花素检测波长为260 nm[17]，左旋紫草素检测波长为516 nm[18]，大黄酸、大黄素和大黄素甲醚检测波长为254 nm[19]，进样量为10 μL。

表1 梯度洗脱程序表

2.2.2 溶液的制备

2.2.2.1 混合对照品溶液的制备 精密称取芒柄花素对照品、左旋紫草素对照品、大黄酸对照品、大黄素对照品、大黄素甲醚对照品适量，加甲醇制成每毫升含芒柄花素62.00 μg、左旋紫草素95.00 μg、大黄酸70.00 μg、大黄素51.00 μg、大黄素甲醚67.00 μg的溶液，即得混合对照品溶液。

2.2.2.2 供试品溶液的制备 取复方紫草解毒软膏5 g，精密称定，加入60 mL石油醚（60～90 ℃）超声使溶解，加入30 mL 0.25 mol/L氢氧化钠溶液，萃取3次，合并3次萃取液，加入稀盐酸调节使其pH为2～3，用三氯甲烷萃取2次，每次50 mL，合并三氯甲烷液，水浴蒸干，残渣加甲醇溶解并定容至25 mL容量瓶中，摇匀，用微孔滤膜（孔径0.22 μm）滤过，取续滤液，即得。

2.2.2.3 阴性对照品溶液的制备 按照复方紫草解毒软膏处方及生产工艺分别制备缺紫草、大黄、鸡血藤的阴性对照品，并按“2.2.2.2”项下方法制备各阴性对照品溶液。

2.2.3 系统适用性试验 取供试品溶液、混合对照品溶液和3种阴性样品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，色谱图见图5。结果色谱峰分离度均达到1.5以上，且阴性对照无干扰；理论塔板数以芒柄花素峰计算应不低于5 000。复方紫草解毒软膏样品中的芒柄花素、左旋紫草素、大黄酸、大黄素和大黄素甲醚成分都能与其他成分明显分离，样品中其他成分对测定成分没有影响。

图5 HPLC 色谱图

2.2.4 线性关系、定量限和检测限考察 精密称取芒柄花素对照品9.82 mg、左旋紫草素对照品10.16 mg、大黄酸对照品8.24 mg、大黄素对照品9.15 mg、大黄素甲醚对照品8.60 mg，置于50 mL容量瓶，加甲醇并稀释至刻度，得混合对照品储备液。精密吸取混合对照品储备液0.5、1、2、4、8 mL，分别置25 mL容量瓶，用甲醇稀释至刻度，配制成5个不同浓度的芒柄花素、左旋紫草素、大黄酸、大黄素、大黄素甲醚对照品溶液，摇匀，各吸取10 μL注入高效液相色谱仪，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，得线性回归方程和线性范围；通过连续稀释混合对照品溶液确定定量限和检测限，当信号和噪声之间的比值为3时所对应的浓度确定为检测限，信号和噪声之间的比值为10时所对应的浓度确定为定量限。（见表2）

表2 5 种成分的线性关系、定量限和检出限

2.2.5 精密度试验 取复方紫草解毒软膏（批号：20210501），按照“2.2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按照“2.2.1”项下色谱条件连续进样6次，结果芒柄花素、左旋紫草素、大黄酸、大黄素、大黄素甲醚峰面积的RSD分别为1.75%、1.21%、0.84%、1.32%、0.91%，表明仪器精密度良好。

2.2.6 稳定性实试验 取复方紫草解毒软膏（批号：20210501），按照“2.2.2.2”项下方法制备供试品溶液，分别于供试品溶液制备后0、2、4、8、12、24 h按照“2.2.1”项下色谱条件进样测定，结果芒柄花素、左旋紫草素、大黄酸、大黄素、大黄素甲醚峰面积的RSD分别为2.04%、1.81%、1.15%、1.17%、2.53%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.2.7 重复性试验 取复方紫草解毒软膏（批号：20210501），按照“2.2.2.2”项下方法平行制备6份供试品，按照“2.2.1”项下色谱条件进样测定，结果芒柄花素、左旋紫草素、大黄酸、大黄素、大黄素甲醚的平均含量分别为0.098、0.216、0.125、0.172、0.139 mg/g，RSD分别为2.53%、1.42%、2.75%、2.20%、2.81%，表明方法重复性良好。

2.2.8 加样回收率试验 精密称取已知含量的复方紫草解毒软膏样品（批号：20210501）2.5 g，共6份，分别精密加入芒柄花素、左旋紫草素、大黄酸、大黄素、大黄素甲醚对照品储备液适量，按照“2.2.2.2”项下方法制备供试品溶液，取适量样品溶液13 000 r/min离心10 min，取上清液用0.22 μm微孔滤膜过滤，按照“2.2.1”项下色谱条件进行测定，计算样品中的芒柄花素、左旋紫草素、大黄酸、大黄素和大黄素甲醚的含量，并计算加样回收率，结果芒柄花素、左旋紫草素、大黄酸、大黄素、大黄素甲醚的平均加样回收率分别为99.71%、98.60%、99.84%、99.42%、98.92%，RSD分别为2.93%、2.57%、2.80%、2.97%、2.77%（n=6），表明方法准确度良好。（见表3）

表3 加样回收率试验结果 （n=6）

2.2.9 样品含量测定 取不同批号复方紫草解毒软膏，按照“2.2.2.2”项下方法制备供试品溶液，并按照“2.2.1”项下色谱条件测定并计算复方紫草解毒软膏中芒柄花素、左旋紫草素、大黄酸、大黄素、大黄素甲醚的含量。（见表4）

表4 复方紫草解毒软膏样品测定结果 （n=3，mg/g）

3 讨 论

3.1 样品处理分析 复方紫草解毒软膏是一种软膏剂，软膏中的基质对含量测定有一定的影响，所以采用石油醚溶解软膏剂后再用酸液、碱液萃取制备供试品溶液，可有效减少基质对含量测定的影响。同时在操作萃取时应使其水相和有机相充分分层，使油性基质去掉，可以避免其对色谱柱造成的损坏。

3.2 色谱条件的选择 查阅相关文献[20-22]发现，芒柄花素、左旋紫草素、大黄酸、大黄素、大黄素甲醚的色谱条件多采用乙腈-磷酸系统，使用的磷酸浓度有0.05%、0.1%、0.2%。预实验发现选用0.1%的磷酸浓度，峰形较好无拖尾现象。由于复方紫草解毒软膏为复方软膏制剂，成分较多，本研究通过多次反复调节流动相比例，分析色谱峰最终选取乙腈-0.1%磷酸系统梯度洗脱。该方法可以使样品中芒柄花素、左旋紫草素、大黄酸、大黄素、大黄素甲醚色谱峰与其他成分的色谱峰达到较好的分离。

3.3 待测成分的选择及分析 紫草主要有效成分左旋紫草素为萘醌类化合物，具有酚羟基，呈酸性，因此能被碱性溶液提取并溶于溶液中。由此左旋紫草素与油性基质实现初步分离，然后用酸性溶液酸化后又可使左旋紫草素析出。大黄的主要活性成分大黄酸、大黄素和大黄素甲醚是蒽醌类化合物，鸡血藤的主要有效成分芒柄花素是一种异黄酮类成分[23]。4种成分均具有酚羟基，呈酸性，因此能被碱性溶液提取并溶于溶液中。其成分与油性基质实现初步分离，酸性溶液酸化后又可使其成分析出。综上所述，实验中软膏剂样品处理先用0.25 mol/L的氢氧化钠溶液提取，再用稀盐酸调节溶液pH为2～3，然后再用三氯甲烷进行萃取。

3.4 薄层鉴别分析 由于复方紫草解毒软膏为乳膏制剂，紫草、黄连、大黄和鸡血藤药材的薄层鉴别在TLC鉴别分析过程中样品的处理极其重要。为了达到干扰小、易检出的目的，本研究首先取部分乳膏用硅胶研和并干燥，使乳膏均匀吸附在硅胶上，为进一步的供试品制备提供前提物质。复方紫草解毒软膏使用石油醚（60～90 ℃）超声使其溶解，然后加入0.25 mol/L氢氧化钠溶液提取，用稀盐酸调节样品溶液的pH值为2～3，再用三氯甲烷提取，合并三氯甲烷液，水浴蒸干，残渣加适量甲醇溶解即为供试品。