三磷腺苷合酶抑制因子1对2型糖尿病的诊断效能

关丫丫，钟根深，王 伟，路 申，杨秀珍，叶建平

(1.新乡医学院第三附属医院检验科/新乡医学院第三临床学院,河南 新乡 453003;2.新乡医学院医学检验学院,河南 新乡 453003;3.河南省分子诊断与医学检验技术协同创新中心,河南 新乡 453003;4.郑州大学附属郑州中心医院代谢研究中心,河南 郑州 450007)

2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)是一种多系统疾病,主要由于胰腺β细胞的胰岛素分泌受损(胰岛素减少症)和代谢活跃组织中的胰岛素信号传导缺陷(胰岛素抵抗)引起,主要特征是慢性高血糖症状。T2DM会导致心脏、血管系统、眼睛、肾脏、大脑和神经受损,使患者的生活质量和预期寿命下降。内脏肥胖、低体力活动、高热量饮食和高龄是 T2DM 的主要危险因素,与炎症和代谢/氧化应激相关的代谢紊乱是T2DM的主要发病机制。有研究报道,代谢活跃的组织和胰腺 β 细胞中的线粒体功能障碍与 T2DM 的发展有关[1-4]。ANTOUN等[5]研究发现,T2DM肥胖患者的肌肉样本中线粒体氧化磷酸化 (mitochondrial oxidative phosphorylation,OXPHOS) 系统(包含电子传递链和ATP合酶)受损。有研究报道,OXPHOS 功能障碍可导致β-氧化和 ATP 生成减少以及活性氧生成增加,从而导致胰岛素抵抗和 ATP 依赖性胰岛素分泌缺陷[6-10]。核编码蛋白三磷腺苷合酶抑制因子1(adenosine triphosphate synthase inhibitory factor 1,ATPIF1)是线粒体ATP合酶的内源性抑制剂。长期以来,ATPIF1 被认为是 ATP 合酶的单向抑制剂,仅通过在缺氧状态下抑制ATP 合酶的水解酶活性(即 ATP 酶活性)发挥作用[11]。最近研究发现,ATPIF1 也可能在正常呼吸条件下部分抑制 ATP 合酶的合成活性(即 ATP 合成),从而限制 OXPHOS[11]。同时,在体循环中发现了ATPIF1,且循环中ATPIF1 与心血管疾病发生风险呈负相关[12-14]。本课题组前期研究显示,髙脂诱导的ATPIF1基因敲除肥胖小鼠可出现血糖升高、胰岛素抵抗、线粒体功能亢进等表现[15]。基于此,本研究分析了血清ATPIF1和外周血ATPIF1 mRNA 表达水平与T2DM的相关性,以期为临床T2DM的诊断提供参考指标。

1 资料与方法

1.1 一般资料选择2021年5月至2021年9月新乡医学院第三附属医院内分泌科收治的80例T2DM患者为研究对象,其中男43例,女37例;年龄 40～70(56.58±6.15)岁。病例纳入标准:(1)符合中国2型糖尿病防治指南(2020版)[16]关于T2DM的诊断标准;(2)年龄40～70岁;(3)患者之间无血缘关系。排除标准:(1)患慢性肝病、甲状腺功能亢进、肢端肥大症、胰腺瘤、脑垂体瘤等疾病者;(2)长期应用激素类药物、镇静药物、抗癌药物的患者;(3)存在外伤、手术等各种应激情况者。选择同期在本院体检健康者80例为健康对照组,其中男43例,女37例;年龄40～70(56.70±5.98)岁。2组受试者的性别分布和年龄比较差异无统计学意义(P>0.05),具有可比性。本研究获得医院医学伦理委员会审核批准(批准文号:K2020-034-01)。

1.2 方法

1.2.1 血清血糖(glucose,GLU)、总胆固醇(total cholesterol,TC)、三酰甘油(triacylglycerol,TG)、低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoprotein cholesterol,LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(high-density lipoprotein cholesterol,HDL-C)水平检测采集2组受试者外周静脉血4 mL,3 000 r·min-1离心3 min分离血清,应用AU5800生物化学分析仪(美国Beckman Coulter公司)采用己糖激酶法检测血清GLU水平,采用氧化酶法检测血清TC、TG水平,采用直接法检测血清LDL-C、HDL-C水平,试剂购自上海科华生物工程股份有限公司,严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.2.2 酶联免疫吸附法检测血清中胰岛素(insulin,INS)、C-肽和ATPIF1水平采集2组受试者外周静脉血4 mL,3 000 r·min-1离心3 min分离血清,应用全自动Phomo酶标仪(美国Thermo Fisher公司),采用酶联免疫吸附法检测血清中INS、C-肽及ATPIF1水平,试剂盒购自上海江莱生物科技有限公司,严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.2.3 离子交换高效液相色谱法检测糖化血红蛋白(glycosylated hemoglobin,HbA1c)水平采集2组受试者外周静脉血4 mL,应用HbA1c检测仪(深圳普门科技股份有限公司)采用离子交换高效液相色谱法检测HbA1c水平,试剂盒购自深圳普门科技股份有限公司,严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.2.4 实时荧光定量聚合酶链式反应法检测外周血单核细胞中ATPIF1 mRNA相对表达量采集2组受试者乙二胺四乙酸抗凝全血标本4 mL,应用淋巴细胞分离液提取单核细胞,采用TRIzol法提取总RNA,反转录为cDNA,应用7500 Fast Real-Time 实时荧光定量聚合酶链式反应扩增仪(美国Thermo Fisher公司)及配套试剂盒进行扩增。ATPIF1上游引物序列为5′-CGATATTTCCGAGCACAGAGTAG-3′,下游引物序列为5′-TGCTTATGGCGCTCAATTTCTTT-3′;人β-actin 上游引物序列为5′-ACTCTTCCAGCCTTCCTTC-3′,下游引物序列为5′-GGAGCAATGATCTTGATCTTC-3′,引物购自上海英潍捷基公司。PCR反应体系(总体积20.0 μL):SYBRTMSelect Master Mix 10.0 μL,上下游引物各4.5 μL,cDNA (110稀释) 1.0 μL。反应程序:95 ℃ 预变性10 min,95 ℃变性15 s,60 ℃延伸1 min,共40个循环;以β-actin为内参,采用2-△△Ct法计算ATPIF1 mRNA相对表达量。

2 结果

2.1 2组受试者的GLU、TC、TG、HDL-C、LDL-C、HbA1c、INS、C-肽、ATPIF1水平及外周血单核细胞中ATPIF1 mRNA表达水平比较结果见表1。T2DM组患者的GLU、HbA1c、INS、C-肽水平显著高于健康对照组,血清ATPIF1水平、外周血单核细胞中ATPIF1 mRNA相对表达量显著低于健康对照组,差异有统计学意义(P<0.05);2组受试者的TC、TG、HDL-C、LDL-C水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。

表1 2组受试者的GLU、TC、TG、HDL-C、LDL-C、HbA1c、INS、C-肽、ATPIF1水平及外周血单核细胞中ATPIF1 mRNA相对表达量比较Tab.1 Comparison of the levels of GLU,TC,TG,HDL-C,LDL-C,HbA1c,INS,C-peptide,ATPIF1 and the relative expression of ATPIF1 mRNA in peripheral mononuclear cells of subjects between the two groups

2.2 血清ATPIF1水平、外周血单核细胞中ATPIF1 mRNA相对表达量及GLU、INS、C-肽和HbA1c水平诊断T2DM的效能比较结果见图1、图2和表2。血清ATPIF1水平预测T2DM的AUC为0.916(95%置信区间:0.873～0.960,P<0.05);当ATPIF1以1.37 μg·L-1为截断点时,Youden指数为0.738,敏感度为93.8%,特异度为80.0%。外周血单核细胞中ATPIF1 mRNA相对表达量预测T2DM的AUC为0.965(95%置信区间:0.943～0.988,P<0.05);当ATPIF1 mRNA相对表达量以0.95为截断点时,Youden指数为0.838,敏感度为83.8%,特异度为100.0%。GLU、HbA1c、INS、C-肽诊断T2DM的AUC分别为1.000、0.991、0.883、0.648。 血清ATPIF1水平和外周血单核细胞中ATPIF1 mRNA 相对表达量预测T2DM的Youden指数显著低于GLU和HbA1c,显著高于INS和C-肽,差异均有统计学意义(P<0.001)。

图1 血清ATPIF1和外周血单核细胞中ATPIF1 mRNA诊断T2DM的ROC曲线Fig.1 ROC curve of serum ATPIF1 level and expression level of ATPIF1 mRNA in peripheral monocyte in the diagnosis of T2DM

图2 血清GLU、HbA1c、INS和C-肽水平诊断T2DM的ROC曲线 Fig.2 ROC curve of serum GLU,HbA1c,INS and C-peptide levels in the diagnosis of T2DM

表2 血清ATPIF1、GLU、HbA1c、INS、C-肽水平及外周血单核细胞中ATPIF1 mRNA的相对表达量诊断T2DM的效能Tab.2 Efficacy of serum ATPIF1,GLU,HbA1c,INS,C-peptide levels and relative expression level of ATPIF1 mRNA in peripheral blood mononuclear cell in diagnosing T2DM

3 讨论

肥胖可通过诱导胰岛素抵抗增加T2DM的患病风险[17]。细胞内ATP是细胞内主要的能量来源,其水平升高是胰岛素抵抗的危险因素[18]。胰岛素抵抗是细胞能量过剩的反馈调节,通过底物控制线粒体超载。因此,在底物供应过剩的细胞保护反应中,ATP可能是胰岛素抵抗的主要信号。预防ATP过量生产是INS增敏的关键策略[17]。虽然之前的很多研究已经评估了内源性ATPIF1的生理作用[19],但尚未研究ATPIF1在T2DM中的作用。本课题组前期研究表明,ATPIF1基因敲除可增加成纤维细胞中ATP水平,促进成纤维细胞向白色脂肪细胞分化,提高白色脂肪细胞储存三酰甘油的能力[15],推测ATPIF1的缺失会使ATP过度生成,小鼠更易变得肥胖,对糖尿病的形成是一个危险因素。有研究发现,ATPIF1基因变异(rs3767303)与男性的肥胖患病率和代谢参数显著相关,而对女性则不明显[20];更具体地说,男性次要等位基因(rs3767303)携带者肥胖患病率较低。另有研究表明,ATPIF1参与人类肥胖和代谢特征的改变[20]。因此,探讨 ATPIF1 对T2DM的诊断价值对临床T2DM的诊断有重要意义。

本研究结果显示,T2DM患者的GLU、HbA1c、INS和C-肽水平显著高于健康对照组,T2DM患者的血清ATPIF1水平、外周血单核细胞中ATPIF1 mRNA相对表达量显著低于健康对照组;这说明,T2DM患者发生了胰岛素抵抗,ATPIF1水平降低使ATP合酶受到的抑制作用减弱,导致ATP合成过量,而过量的ATP使INS敏感性降低,易使患者发生胰岛素抵抗,最终进展为T2DM[17]。国外研究结果显示,将重组ATPIF1注射到高脂饮食喂养的去卵巢雌性小鼠中,可显著减少小鼠的食物摄入和体质量[20],因此,推测体内注射一定剂量的重组ATPIF1蛋白,可增加血循环中ATPIF1水平,抑制ATP过度生成,增加INS敏感性,从而降低T2DM的患病率。此外,本研究结果显示,血清ATPIF1水平预测T2DM的AUC为0.916,当ATPIF1以1.37 μg·L-1为截断点时,Youden指数为0.738,敏感度为93.8%,特异度为80.0%;外周血单核细胞中ATPIF1 mRNA预测T2DM的AUC为0.965,当ATPIF1 mRNA相对表达量以0.95为截断点时,Youden指数为0.838,敏感度为83.8%,特异度为100.0%;血清ATPIF1水平和外周血单核细胞中ATPIF1 mRNA相对表达量预测T2DM的Youden指数显著低于GLU和HbA1c,显著高于INS和C-肽;这说明,ATPIF1诊断T2DM的效能低于GLU和HbA1c,但优于INS和C-肽,ATPIF1可作为诊断T2DM基因水平的生物标志物,且能够在基因水平指导T2DM的预防和治疗。

综上所述,T2DM患者的血清ATPIF1水平及外周血单核细胞ATPIF1 mRNA表达水平可作为诊断T2DM基因水平的生物学标志物,且可预测糖尿病前期患者向新发生糖尿病的转化过程。