miR-27a,miR-138-5p对食管癌的早期诊断价值及与其病理分化程度的关系研究

赵蓓蓓 吴 帅

食管癌是消化道常见恶性肿瘤,发病率和死亡率均较高,早期症状不明显,诊断困难,70%～80%患者确诊时已为中晚期,临床主要通过手术、放疗和化疗等方式进行治疗,但治疗效果不甚满意,5年生存率仍较低。因此,进行癌前病变及早期病变筛查具有重要意义,寻找有效的生物标志物,对于早期筛查及诊断至关重要。微小RNA(microRNA,miRNA)是一类非编码小分子RNA,可通过调控靶基因,参与体内信号传导通路。miRNA与癌基因或抑癌基因关系密切,可作为肿瘤早期诊断的基础,多种miRNA已被证实可作为乳腺癌、肝癌等恶性肿瘤早期诊断标志物及靶向治疗靶点[1-2]。miR-27a与多种肿瘤发生发展过程密切相关,已有研究显示其在食管鳞状癌细胞增殖和迁移过程中发挥调控作用[3]。miR-138-5p在多种肿瘤中表达异常,与非小细胞肺癌肿瘤直径、淋巴结转移等病理特征有关,但其在食管癌中的作用报道尚少[4]。本研究通过实时荧光定量PCR技术检测食管癌患者及正常人血清miR-27a、miR-138-5p表达水平,探讨其对食管癌早期诊断价值及与病理特征的关系,旨在为临床食管癌早期诊断提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 研究对象

选取2019年8月至2020年8月本院收治的食管癌患者73例,设为研究组。其中男性41例,女性32例,年龄38～76岁,平均年龄(65.23±5.26)岁;食管癌分段标准[5]:食管上段16例,中段32例,下段25例;TNM分期[6]:Ⅰ期19例,Ⅱ期32例,Ⅲ期13例,Ⅳ期9例。纳入标准:①符合《食管癌诊疗规范》[7]诊断标准;②内镜检查及组织活检确诊为食管癌;③首次确诊,未接受过手术、放化疗及其他抗癌治疗;④相关影像学及内径资料,可进行肿瘤分期。排除标准:①年龄<18岁;②合并其他肿瘤;③合并严重慢性基础性疾病或感染性疾病;④孕妇及哺乳期妇女。另选取同期本院体检的健康人群59例,设为对照组,其中男性32例,女性27例,年龄35～78岁,平均年龄(66.21±5.89)岁,对照组人员体检结果均正常,无既往肿瘤史。研究组与对照组年龄、性别构成比无显著差异(P>0.05)。

本研究经医院伦理委员会审批通过,所有参与者均对研究内容知情同意。

1.2 主要试剂和仪器

主要试剂:Trizol试剂(美国Invitrogen公司),SYBR Green qPCR Mix(德国merck公司),ThemoScript RT试剂盒(美国Invitrogen公司)。主要仪器:紫外分光光度计(德国Sartorius公司),PCR仪(美国Eppendorf公司)。

1.3 方法

1.3.1 标本采集与处理 分别采集两组受试者清晨空腹肘静脉血5 mL,抗凝管内静置30 min,3500 r/min离心室温15 min,取上清,-80 ℃保存。

1.3.2 血清总RNA提取 取保存血清样本,解冻后加入Trizol试剂,充分混匀,12000 r/min离心5 min,加入氯仿室温放置5 min,加入异丙醇室温放置10 min,离心取上清,提取血清总RNA,采用紫外分光光度计测定260 nm和280 nm处吸光度(A)值,检测RNA浓度和纯度,A260nm/A280nm比值在1.8～2.1之间,表示提取的总RNA纯度较高,可用于后续实验。

1.3.3 逆转录反应 严格按照试剂盒说明书操作步骤,进行逆转录cDNA。逆转录反应体系:1 μL总RNA,1 μL dNTP Mixture,2 μL 5×RT Buffer,0.5 μL RNA酶抑制剂,1 μL 逆转录酶,加ddH2O至总体积20 μL。45 ℃反应30 min,85 ℃反应5 min。

1.3.4 实时荧光定量PCR 实时荧光定量PCR进行扩增。配制PCR扩增反应体系:SYBR Premix Ex Taq II 10 μL,上下游引物各0.5 μL,cDNA模板3 μL,加ddH2O至总体积20 μL。PCR反应条件:预变性95 ℃ 5 min,变性95 ℃ 10 s,退火60 ℃ 20 s,延伸72 ℃ 5 s,40个循环。以U6为内参,2-△△CT法对miR-27a,miR-138-5p进行相对定量,重复检测3次,取平均值。实验所用引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,引物序列见表1。

表1 PCR引物序列

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 2组血清miR-27a、miR-138-5p水平比较

研究组血清miR-27a表达水平高于对照组,miR-138-5p表达水平低于对照组(P<0.05)。见表2。

表2 2组血清miR-27a、miR-138-5p水平比较

2.2 血清miR-27a、miR-138-5p表达与食管癌临床病理特征的关系

血清miR-27a、miR-138-5p在不同年龄、性别、肿瘤位置及病理类型患者中表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。随着病理分化程度升高,血清miR-27a表达水平降低、miR-138-5p表达水平升高(P<0.05);淋巴结发生转移患者血清miR-27a高于未转移患者、miR-138-5p表达水平低于未转移患者(P<0.05);TNM分期IV期患者miR-27a表达水平最高、miR-138-5p表达水平最低,I-II期患者miR-27a表达水平最低、miR-138-5p表达水平最高,各期差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 miR-27a、miR-138-5p表达与患者临床病理特征的关系

2.3 血清miR-27a,miR-138-5p单独及联合检测对食管癌早期诊断价值

ROC结果显示,血清miR-27a,miR-138-5p单独诊断早期食管癌的最佳截断点分别为7.32、2.51,单独及联合诊断的AUC分别为0.786、0.725、0.813,见表4,图1。

表4 血清miR-27a,miR-138-5p单独及联合检测对食管癌的早期诊断价值

图1 miR-27a,miR-138-5p单独及联合检测预测食管癌的ROC曲线

3 讨论

食管癌早期诊断与治疗是降低患者死亡率的关键,目前临床食管癌诊断采用内镜活检,患者依从性差,且存在医源性感染,外周血获取简单,创伤较小,患者容易接受,血清miRNAs在肿瘤早期筛查和诊断中具有广泛应用前景[8]。miRNA在食管癌发生发展过程中发挥重要调控作用,通过靶向降解下游癌基因或抑癌基因,从上游抑制或促进肿瘤发生发展,部分miRNAs可作为肿瘤发生发展标志物,为肿瘤靶向治疗提供潜在靶点[9]。鉴于此,本研究检测食管癌患者与健康人群血清miR-27a、miR-138-5p表达水平,分析两者对食管癌早期诊断的应用价值,结果显示,食管癌患者血清miR-27a表达水平显著高于正常人群,miR-138-5p表达水平显著低于正常人群,与Maghsudlu等[10]报道的miR-27a在食管癌肿瘤组织中表达较高结果一致,Wang等[11]研究显示,miR-138-5p在胃癌组织中表达下调,本研究在食管癌中也得到相似验证,表明miR-27a、miR-138-5p与食管癌发生发展有关。

血清miRNA不易受外界环境影响,能够长期保存,性质稳定,对于临床动态观察患者病情具有重要价值。血清miRNA与肿瘤生长有关,恶性肿瘤患者血清miRNA表达水平在根治性切除治疗后,可逐渐升高/降低,miRNA表达水平可在一定程度预测肿瘤负荷[12]。肿瘤发展不同阶段,miRNA谱系表达不同,可根据差异推测肿瘤恶性进展程度[13]。此外,血清miRNA还存在一定特异性,不同病理类型恶性病变,其miRNA表达谱系表达存在差异,有助于分析临床中来源不明的低分化恶性病变[14]。miRNA异常表达与肿瘤发生发展密切相关,本研究分析血清miR-27a、miR-138-5p表达水平与患者临床特征关系,结果显示,病理分化程度越高,miR-27a表达水平降低、miR-138-5p表达水平升高;并且淋巴结发生转移患者血清miR-27a高于未转移患者、miR-138-5p表达水平低于未转移患者;Ⅳ期患者miR-27a表达水平高于Ⅰ～Ⅱ期及Ⅲ期患者,而miR-138-5p表达水平较低,表明miR-27a、miR-138-5p表达在食管癌中具有较高敏感度,与食管癌恶性程度有关。

食管癌临床特征发展不稳定,进展过程中有多个基因共同参与调控,目前临床常用的血清肿瘤标志物鳞状细胞癌抗原、C反应蛋白和细胞角蛋白19片段等,存在特异性不高、灵敏度差等问题,尤其对食管癌早期病变诊断价值不明显。本研究进一步采用ROC曲线分析miR-27a、miR-138-5p在食管癌中的诊断价值,结果显示,血清miR-27a、miR-138-5p单独及联合诊断早期食管癌的AUC分别为0.786、0.725、0.813,当临界值取7.32时,miR-27a对食管癌诊断价值最大,灵敏度和特异度分别为80.82%、81.36%;当临界值取2.51时,miR-138-5p对食管癌诊断的灵敏度和特异度分别为76.71%、77.97%,表明血清miR-27a、miR-138-5p是食管癌恶性程度增高的敏感指标,对食管癌具有一定诊断价值,两者联合检测诊断价值更高。此外,miR-27a在大肠癌及卵巢癌患者中表达升高,诊断肿瘤敏感度较高,但特异性较低[15]。联合miR-138-5p后,可提高诊断价值,有望成为诊断早期食管癌的分子标志物。

综上所述,血清miR-27a在食管癌患者血清表达升高、miR-138-5p表达下降,与肿瘤病理分化程度、淋巴结转移及TNM分期有关,两者联合检测可为食管癌早期诊断提供依据。但本次研究样本量较少,进一步可利用miR-27a、miR-138-5p在食管癌进展中表达失调,研究其可能作用机制及靶点,为临床靶向治疗食管癌提供潜在靶点。