氮气气调条件下鲜食花生中挥发性物质的变化及其与脂肪酸的相关性

张玉荣,崔春晓,何雅楠,李晨杰,王殿轩,田奇生,吴 琼

河南工业大学 粮食和物资储备学院,粮食储藏与安全教育部工程研究中心, 河南省粮食产后减损工程技术研究中心, 河南 郑州 450001

花生是我国重要的油料作物和经济作物,其富含脂肪、蛋白质、碳水化合物和钙、铁、锌等微量元素以及酚类、类黄酮、白藜芦醇等生物活性成分,经常食用可降低人们患心脏病、心血管疾病、癌症等疾病的风险,因此在民间又被称为“长生果”[1-3]。鲜食花生是指在荚果充实末期,果壳开始变硬时收获,不经晾晒或干燥而直接食用或煮熟后食用的新鲜花生[4]。与普通花生相比,鲜食花生不仅因其食用方式能克服花生榨油或加工所造成的一些重要营养素的流失,而且口感清香且不油腻、味道鲜美,其风味深受消费者的喜欢[5]。但鲜食花生水分含量高,储藏稳定性差,在储藏或销售过程中风味易发生改变。因此开发一种方便有效的储藏方式以延缓鲜食花生储藏过程中的风味劣变,是推动鲜食花生产业发展的重要举措之一。

氮气气调是一种能有效延缓农产品品质劣变的绿色储藏技术[6]。胡玫等[7]研究发现氮气气调能有效延缓花生果储藏期间酸价、过氧化值的升高。张来林等[8]将研究发现,在30 ℃条件下,采用98% N2气调能有效抑制花生酸败,而在35 ℃时不明显。在低温(4 ℃)下,用不同浓度的N2对鲜食花生进行气调包装处理,张玉荣等[9]发现90% N2处理组花生在储藏30 d后仍能保持良好的感官品质。但关于氮气气调对鲜食花生储藏过程中风味品质的影响还鲜有系统报道。

风味包括滋味和香气两个方面,上百种挥发性成分构成了花生中的香气物质。有研究表明脂肪酸代谢是果实香气形成的重要影响因素之一[10]。花生仁中不同脂肪酸组分含量的差异会对不同种类花生所制取的浓香花生油感官风味、挥发性成分及综合指标造成影响[11]。李梓铭等[12]采用HS-SPME-GC-MS分析了茶籽油在精炼前后脂肪酸组成与挥发性风味物质成分,结果表明不饱和脂肪酸含量能有效影响茶籽油的果香风味。因此可以看出脂肪酸对花生及其制品风味的形成具有重要作用。鲜食花生脂肪含量高,且油酸和亚油酸等不饱和脂肪酸含量约占其脂肪酸总量的80%,在储藏过程中易被氧化,从而生成各种挥发性物质[13]。然而,目前关于鲜食花生储藏过程中挥发性物质的变化及其与脂肪酸相关性的研究鲜有系统报道。

本试验以鲜食花生为材料,采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用技术(SPME-GC-MS)探讨90% N2处理对鲜食花生储藏期间挥发性物质的影响,并分析其与脂肪酸的相关性,以期为科学评价氮气气调对鲜食花生风味品质的影响,并为加快氮气气调在鲜食花生实际保鲜中的应用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

鲜食花生样品(开农308)采自开封市花生合作社的农场。在播种后100 d(总生长期约为115 d),人工采摘约100 kg新鲜花生荚果,采后2 h内送到实验室,然后挑选大小一致、无虫害、相对饱满的花生荚果约60 kg,用自来水冲洗表面泥土后,将其置于0.3%次氯酸钠溶液中浸泡5 min,用蒸馏水冲洗3次后在室温下自然通风,待果壳表面晾干后进行气调包装。

90% N2：由N2(纯度≥99.999%)和O2(纯度 ≥ 99.999%)按9∶1的体积比混合制备而成,购于河南源正科技发展有限公司。PET/PE真空包装袋：28 cm×40 cm,16丝,透氧率为380 cm3·m-2·d-1·MPa-1,水蒸气透过率为2 g·m-2·d-1。

1.2 主要试剂

石油醚、盐酸、无水乙醇、氢氧化钠、氯化钠、无水硫酸钠：分析纯,洛阳化学试剂厂;正己烷、甲醇：色谱纯,上海阿拉丁试剂有限公司。

1.3 主要仪器与设备

FR400B手压式塑料薄膜封口机：上海义光包装设备制造有限公司;QP2010 Ultra气质联用仪：日本岛津公司;7890A气相色谱仪：安捷伦科技有限公司。

1.4 试验方法

1.4.1 氮气气调处理

将挑拣清理后的带壳鲜食花生样品随机装入PET/PE真空包装袋中,每袋500 g,抽真空后向包装袋中分别充入90% N2和空气(CK),用封口机热封后在4 ℃、RH 75%条件下避光储藏30 d,每5 d随机取样1次,所有处理设3个重复。

1.4.2 脂肪酸的测定

参照GB 5009.168—2016《食品中脂肪酸的测定》归一化法进行测定。

1.4.3 挥发性物质的测定

1.4.3.1 鲜食花生挥发性物质的提取

参考张蓝月[14]使用的方法并稍做修改。取3.0 g粉碎后的鲜食花生样品于15 mL顶空瓶中,在60 ℃下平衡30 min,然后将萃取针插入顶空瓶中萃取30 min后立刻将萃取针头插入气相色谱仪进样口,在250 ℃下解析5 min后开始分析。

1.4.3.2 GC-MS分析条件

色谱柱：DB-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)石英毛细管色谱柱;载气：氦气;流速：1 mL/min,不分流;升温程序：前进样口温度为 250 ℃,柱温为50 ℃,保持 2 min,再以 7 ℃/min升至 90 ℃,保持 4 min,然后以 3.5 ℃/min 升至 170 ℃,保持 2 min;质谱接口温度：230 ℃;质谱扫描范围：33～300m/z;离子源：EI;离子源温度：230 ℃;电离电压：70 eV。

1.5 数据处理

用Microsoft Excel 2010对试验数据进行统计处理,使用IBM SPSS Statistics 22.0进行单因素方差分析和主成分分析,运用Origin 2018作图。GC-MS数据由岛津软件系统处理,将收集的质谱与NIST08标准质谱库和参考化合物的保留时间进行匹配,进而对质谱结果中的挥发性物质进行鉴定,采用峰面积归一化法计算挥发性物质的相对含量。使用在线分析网站(http：//huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy/root?tool_id=PICRUSt_normalize)对鲜食花生的挥发性物质进行LDA Effect Size(LEfSe)分析。

2 结果与讨论

2.1 氮气气调对鲜食花生脂肪酸的影响

氮气气调对鲜食花生脂肪酸的影响如表1所示。由表1可知,在储藏过程中,鲜食花生共包含9种脂肪酸,其中油酸相对含量最高,占比在80%左右,其次是棕榈酸和亚油酸,且其脂肪酸种类未发生改变。鲜食花生不饱和脂肪酸的相对含量随着储藏时间的延长呈下降的趋势,其中亚油酸和亚麻酸下降最明显,这与袁贝等[15]在干花生中的研究结果一致。但90% N2处理组亚油酸的相对含量在整个储藏期间均显著高于CK组,亚麻酸的相对含量在第20、30 天显著高于CK组(P<0.05),储藏30 d后,90% N2处理组亚油酸和亚麻酸的相对含量分别是CK组的1.190和1.178倍,表明90% N2处理中较低的氧气浓度能有效抑制亚油酸和亚麻酸的氧化,这与孙强等[16]在芝麻中的研究结果一致。

表1 鲜食花生脂肪酸种类及相对含量的变化Table 1 Changes of fatty acid types and relative content in fresh edible peanuts

2.2 氮气气调对鲜食花生挥发性物质种类及相对含量的影响

2.2.1 鲜食花生挥发性物质的主成分分析

鲜食花生在整个储藏期内共检测出31种挥发性化合物(表2),其中烃类9种,醇类7种,醛类8种,酯类4种,杂环类3种。

为了全面了解氮气气调对鲜食花生储藏过程中挥发性成分的影响,对所有挥发性成分数据进行了主成分分析(图1)。由图1可知,第1主成分的贡献率为34.2%,第2主成分的贡献率为23.4%,第3主成分的贡献率为15.7%,前3个主成分的总贡献率为73.3%,说明前3个主成分能够较好地反映原有数据信息。在第10 天时,CK组和90% N2处理组样品在PC2和PC3上存在明显差异;第20 天时,CK组和90% N2处理组样品在PC2上存在明显差异;第30 天时,CK组和90% N2处理组样品在PC2上存在明显差异。主成分分析结果显示,CK组和90% N2处理组样品的挥发性物质在整个储藏过程中均存在明显差异,表明90% N2处理有效地影响了鲜食花生储藏过程中香气成分的变化。

图1 鲜食花生挥发性成分的主成分分析Fig.1 Principal component analysis of volatile components in fresh edible peanuts

2.2.2 烃类物质

图2 氮气气调对鲜食花生储藏过程中烃类、醇类、醛类、酯类和杂环类物质相对含量的影响Fig.2 Effect of nitrogen modified atmosphere on the relative content of hydrocarbons, alcohols, aldehydes, esters, and heterocycles compounds in fresh edible peanuts during storage

烃类物质主要来自脂肪酸烷基自由基均裂,能反映果实脂肪酸的氧化速率[17],但其气味阈值较高,对果实的风味影响不大[18]。氮气气调对鲜食花生储藏过程中烃类物质相对含量的影响如图2所示。由表2和图2可知,CK组烃类物质的相对含量随储藏时间的延长呈快速升高的趋势,而90% N2处理组在0～10 d缓慢下降,之后缓慢上升。CK组烃类物质的相对含量在第10、20和30 天分别为55.27%、57.49%和85.63%,较初始样品显著升高,且分别是90% N2处理组的9.06、2.15和2.42倍。正癸烷是初始样品中相对含量最高的烃类物质,但随储藏时间的延长,其相对含量不断降低,而2,2,4,6,6-五甲基庚烷成为CK组和90% N2处理组中相对含量最高的烃类物质。储藏30 d后,90% N2处理组中2,2,4,6,6-五甲基庚烷的相对含量仅为CK组的41.39%。另外,除2,2,4,6,6-五甲基庚烷外,其他烃类物质的相对含量均较小。结果显示,在储藏过程中,鲜食花生烃类物质的相对含量呈升高的趋势,其中2,2,4,6,6-五甲基庚烷是主要的烃类物质。90% N2处理有效抑制了鲜食花生中烃类物质的升高,表明90% N2处理能有效抑制鲜食花生中脂肪酸的氧化,这与2.1中的研究结果一致。

表2 鲜食花生挥发性物质及其相对含量Table 2 Volatile substances and their relative content in fresh edible peanuts

2.2.3 醇类物质

醇类物质主要由脂肪酸氧化产生,脂肪酸可在脂氧合酶(LOX)作用下被氧化生成氢过氧化物,然后在氢过氧化物裂解酶(HPL)的作用下生成醛类,之后经乙醇脱氢酶(ADH)催化生成醇类[10]。醇类物质的气味阈值较高,对含脂果实的风味贡献不大[19]。由表2和图2可知,随储藏时间的延长,CK组和90% N2处理组醇类物质的相对含量均呈波动变化的趋势,其中在第20 天时达到最高。CK组醇类物质的相对含量在第10、20、30 天分别是初始样品的31.72%、145.42%和25.19%,90% N2处理组则分别为初始样品的60.57%、127.83%和98.63%。桉叶油醇和正己醇是CK组和90% N2处理组中相对含量较高的醇类物质。储藏30 d后,90% N2处理组中桉叶油醇和正己醇的相对含量是初始样品的112.55%和110.84%,而CK组中桉叶油醇的相对含量仅为初始样品的27.57%和37.58%。结果表明,与CK处理相比,90% N2处理有利于保持鲜食花生储藏过程中醇类物质相对含量的稳定。

2.2.4 醛类物质

醛类物质的气味阈值低,对含脂果实总体风味具有重要影响[19]。Pattee等[20]研究表明己醛是鲜花生中的主要挥发性风味物质。Chetschik等[21]研究发现3-甲硫基丙醛、2-异丙基-3-甲氧基吡嗪和乙酸是生花生中主要的香气成分。谢妍纯等[22]研究表明异丁醛、异戊醛、2- 甲基丁醛、苯甲醛、戊醛、己醛、柠檬烯是水煮花生中主要的香气成分,醛类物质较多使水煮花生呈清甜香。可以看出,在以上研究中花生主要的香气成分虽然有所不同,但结果均表明醛类物质对花生的风味具有重要影响。花生的香气成分主要与其品种、成熟度、水分含量、储藏环境等因素有关[23]。由表2和图2可知,CK组醛类物质的相对含量随储藏时间的延长快速下降,而90% N2处理组在0～10 d缓慢升高,之后呈缓慢下降的趋势。在第10天和第20天时,醛类物质均是90% N2处理组中相对含量最高的挥发性成分,且在第30天时N2处理组中醛类物质相对含量仅次于烃类。90% N2处理组醛类物质的相对含量在第10、20、30 天时分别是CK组的3.44、5.03、4.15倍。在储藏期间,90% N2处理组醛类物质的检出数量较CK组多,其中反-2-癸烯醛和苯乙醛均只在90% N2处理组中被检出,且它们在花生中分别呈现脂香味和果香味[24-25]。另外,在储藏过程中,2-己烯醛、壬醛、反,反-2,4-壬二烯醛、反,顺-2,6-壬二烯醛和反-2-壬烯醛是鲜食花生中相对含量较高的醛类物质。储藏30 d后,90% N2处理组中壬醛、反,反-2,4-壬二烯醛、反,顺-2,6-壬二烯醛和反-2-壬烯醛的相对含量分别是CK组的3.86、1.98、17.75、3.79倍,2-己烯醛的相对含量为1.98%,但在CK组中未检出。壬醛、反,反-2,4-壬二烯醛等醛类物质主要呈青鲜味、脂香味或花香味等[10,25]。以上研究结果显示,在储藏期间,鲜食花生醛类物质的相对含量总体呈下降的趋势,但90% N2处理组醛类物质的下降速率远低于CK组,表明90% N2处理能有效抑制鲜食花生储藏过程中醛类物质的下降,从而抑制鲜食花生风味的变化。

2.2.5 酯类物质

C1-C10的酯类物质一般具有果香的风味,长链酯类则主要呈脂香味,但长链酯类物质的气味阈值较高,对果实的风味影响较小[26]。酯类物质的合成主要通过两种途径：一种是脂肪酸在β-氧化的作用下生成酸类,之后被还原成相应的醛类和醇类,最后在醇酰基转移酶(AAT)的作用下生成酯类;另一种是脂肪酸在脂氧合酶(LOX)作用下被氧化生成氢过氧化物,然后在相关酶的作用下生成醛类、醇类,最后在AAT的作用下可生成相对应的酯类[10]。由表2和图2可知,CK组酯类物质的相对含量在0～20 d不断升高,之后快速下降,而90% N2处理组随储藏时间的延长呈不断升高的趋势。初始样品中未检出酯类物质,CK组酯类物质的相对含量在第10、20、30 天分别为1.57%、3.68%、0.52%,90% N2处理组分别为2.26%、5.13%、10.80%。在储藏期间,鲜食花生仅检测出4种酯类物质,且相对含量均较低,其中硬脂酸乙酯和己酸乙酯仅在90% N2处理组中被检出。对比来看,在储藏过程中,90% N2处理组酯类物质的相对含量较CK组高,但整体来看,两组酯类物质的相对含量均较低。CK组酯类物质的相对含量较低的原因可能是脂肪酸烷基自由基均裂导致烃类物质的相对含量过高。Chervin等[27]研究表明酯类物质的含量一般随果实的成熟而升高,但低氧环境中会在一定程度上抑制AAT活性,进而降低酯类物质的合成。因此,推测90% N2处理组中较低的氧气浓度可能是造成鲜食花生在储藏过程酯类物质的相对含量较低的原因。

2.2.6 杂环类物质

由表2和图2可知,CK组和90% N2处理组杂环类物质的相对含量在储藏过程中均呈波动下降的趋势。储藏30 d后,CK组和90% N2处理组杂环类物质的相对含量分别为1.47%和3.57%。在储藏过程中,在鲜食花生中仅检出3种杂环类物质,且相对含量均较低。结果表明,90% N2处理对鲜食花生中杂环类物质的影响较小。

2.3 氮气气调条件下鲜食花生挥发性物质的LEfSe分析

LEfSe是一种基于线性判别分析(linear discriminant analysis,LDA)效应量(effect size)的分析方法,可以通过两个或多个分组之间的比较,达到筛选组间具有统计学差异的标志物的目的[28]。采用LEfSe方法对挥发性物质进行分析时,需要进行两步统计检验,首先进行Kruskal-Wallis秩和检验,检测出具有统计学差异的分组,然后对具有统计学差异的分组之间进行Wilcoxon秩和检验,从而找出具有统计学差异的挥发性物质。LEfSe分析方法能极大地降低出现假阳性判断的概率,目前在微生物组学Biomarker的寻找中已被广泛应用[29]。为了更科学规范地筛选出90% N2处理组和CK组中的特征性挥发性物质,对两组鲜食花生储藏过程中的挥发性物质进行了LEfSe分析,结果如图3和图4所示。

注：内圈表示挥发性物质的种类,外圈表示某个特定的挥发性物质,圆圈的大小与挥发性物质的相对含量成正比。黄色点表示无显著差异的挥发性物质,红色点表示在CK组中具有关键作用的挥发性物质,绿色点表示在90% N2处理组中具有关键作用的挥发性物质。图3 鲜食花生挥发性物质的LEfSe分析Fig.3 LEfSe analysis of volatile substances in fresh edible peanuts

注：LDA得分图是基于筛选出的具有统计学差异的挥发性物质绘制的,LDA分数的阈值为2,柱子的颜色代表不同的分组,长短代表LDA得分。图4 鲜食花生挥发性物质的LDA得分Fig.4 LDA score of volatile substances in fresh edible peanuts

如图3所示,内圈中的红色点和绿色点分别代表烃类和醛类,而另外3个黄色点顺时针依次代表醇类、杂环类和酯类,表明烃类和醛类是区分CK组和90% N2处理组中挥发性物质变化的关键物质。从外圈看,红色点连接的挥发性物质为正癸烷(comp1)和2,2,4,6,6-五甲基庚烷(comp5),绿色点连接的挥发性物质为桉叶油醇(comp11)、壬醛(comp18)、反-2-壬烯醛(comp19)、反,反-2,4-壬二烯醛(comp20)和邻苯二甲酸二丁酯(comp25)。由图4可知,绿色点连接的挥发性物质的LDA得分从高到低依次是桉叶油醇(comp11)、反,反-2,4-壬二烯醛(comp20)、邻苯二甲酸二丁酯(comp25)、反-2-壬烯醛(comp19)、壬醛(comp18);红色点连接的挥发性物质的LDA得分从高到低依次是2,2,4,6,6-五甲基庚烷(comp5)、正癸烷(comp1)。以上结果表明,烃类和醛类分别在CK组和90% N2处理组具有关键作用,其中2,2,4,6,6-五甲基庚烷和正癸烷是CK组中的特征性挥发性物质,壬醛、反-2-壬烯醛、邻苯二甲酸二丁酯、反,反-2,4-壬二烯醛和桉叶油醇(comp11)(按LDA得分从高到低排序)是90% N2处理组中的特征性挥发性物质。

2.4 相关性分析

为了全面地了解氮气气调对鲜食花生采后储藏期间挥发性成分和脂肪酸的影响,对CK组和90% N2处理组鲜食花生果实的所有挥发性成分和脂肪酸的相对含量进行了相关性分析,并根据得到的皮尔逊相关性系数(r)绘制了热图(图5)。

由图5可知,棕榈酸与1种醇类、1种醛类呈强相关关系;硬脂酸与1种烃类、2种醇类呈强相关关系;油酸与1种烃类、2种醇类、2种醛类、3种酯类呈强相关关系;亚油酸与1种烃类、3种醛类存在强相关关系;花生酸与3种烃类、1种醇类呈强相关关系;亚麻酸与1种烃类、2种醇类、2种醛类、4种酯类呈强相关关系;山嵛酸与2种烃类、2种醇类、1种醛类、2种杂环类存在强相关关系;花生四烯酸与1种醇类、1种醛类呈强相关关系;花生五烯酸与2种烃类、2种醇类、1种醛类存在强相关关系(|r|>0.8)。结果显示,硬脂酸、花生酸、山嵛酸和花生五烯酸主要与少数烃类和醇类物质相关,棕榈酸和花生四烯酸主要与少数醇类和醛类物质相关,亚油酸主要与醛类物质相关,油酸和亚麻酸主要与醇类、醛类和酯类物质相关。可以看出,鲜食花生的脂肪酸与挥发性物质密切相关,说明脂肪酸是鲜食花生挥发性物质合成过程中重要的前体物质,这与谭卓[30]对梨的研究结果相似。

3 结论

与CK处理相比,90% N2处理能有效抑制鲜食花生中亚油酸、亚麻酸的氧化。在储藏过程中,烃类和醛类是鲜食花生中主要的挥发性物质,其次是醇类,而酯类和杂环类物质的相对含量较小。90% N2处理能有效抑制鲜食花生储藏过程中烃类的升高、醛类的降低,并有利于保持醇类物质的稳定,从而有效抑制鲜食花生储藏过程中风味的变化。LEfSe分析结果表明,2,2,4,6,6-五甲基庚烷和正癸烷是CK组中的特征性挥发性物质,邻苯二甲酸二丁酯、桉叶油醇、反,反-2,4-壬二烯醛、反-2-壬烯醛和壬醛是90% N2处理组中的特征性挥发性物质。另外,相关性分析结果显示鲜食花生中脂肪酸和挥发性物质在储藏期间密切相关,说明脂肪酸是鲜食花生挥发性物质合成过程中重要的前体物质。