金线兰茎腐病的病原菌鉴定与防治药剂的筛选

叶 炜, 颜沛沛, 王培育, 罗维鸿, 林敏水, 沈绍榕, 江金兰

[1.福建省(山区)作物遗传改良与创新利用重点实验室,福建 三明 365509;2.三明市农业科学研究院药用植物研究所,福建 三明 365509;3.福建农林大学园艺植物生物工程研究所,福建 福州 350002;4.永安市林业局,福建 永安 366038;5.永安市黄泥家有限责任公司,福建 永安 366038]

金线莲(Anoectochiumroxburghii)为兰科(Orchid)花叶开唇兰属(Anoectochilus)金线兰(A.roxborghil)及其近缘种植物的统称,为多年生草本植物[1],在福建民间为传统用药,有“药王”之称[2]。金线兰及其近缘种植物广泛分布于我国南部,全世界约有40余种,我国有20种2变种,种质资源较为丰富[3-4]。由于野生金线莲价值高昂,我国不同地区的金线莲野生资源已被严重破坏,是国家二级保护植物。金线莲在我国已有30多年的栽培历史[5-6]。为提高金线莲苷、多糖、总黄酮、总酚以及生物碱等有效成分的含量,金线莲需经4～6个月的移栽[7-10]。由于金线莲喜冷凉、阴湿的环境,栽培过程中极易受到茎腐病的影响。目前,茎腐病抗病品种的选育与高效防治技术研发仍较缺乏,开展金线莲茎腐病抗性育种及高效防治技术研究有重要的现实意义。

现已知尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)是金线莲茎腐病致病菌。该菌遗传多样性丰富,可为害多种作物,是研究最为密集的病原菌之一[11-13]。目前虽有少数金线莲茎腐病的病原物鉴定与防治方法的报道,但该病仍是金线莲规模化种植的主要威胁[11-13]。福建永安是我国金线莲的中心产区,素有“中国金线莲之乡”的美称,而茎腐病高发是阻碍金线莲产业推广普及的主要因素。鉴定茎腐病的主要致病菌,分析不同种兰科植物的抗病性以及该致病菌的防治措施将有利于金线莲茎腐病抗性育种及高效防治的开展。本研究在前人工作的基础上,分离鉴定永安金线莲产区尖孢镰刀菌茎腐病致病菌,开展其在5个金线莲栽培种以及其他兰科植物上的致病性分析,测定8种防治药剂对病菌的平板抑菌效果,以期为金线莲茎腐病抗性育种及高效防治提供新的线索。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病样 金线兰[A.roxborghil(wall.) Lindl ]茎腐病植株于2021年8月取自永安市上坪乡七宝农林省级专业合作社种植基地,海拔约1 100 m。

1.1.2 兰科植物种质 金线莲栽培种:福建小圆叶(1#)、红霞(56#)、福建尖叶(16#)、滇南开唇兰(A.burmannicusRolfe)(43#)、台湾银线兰(A.formosanusHayata)(21#),铁皮石斛(DendrobiumofficinaleKimura et Migo)(17C-1),姬蝴蝶兰[Phalaenopsisequestris (Schauer) Rchb. f.]及墨兰[Cymbidiumsinense(Jackson ex Andr.) Willd.],均保存于三明市农业科学研究院药用植物研究所。

1.1.3 供试药剂 化学药剂分别为:甲霜·恶霉灵水剂(江西正邦作物保护股份有限公司,含甲霜灵6%、恶霉灵25%);咪鲜胺水乳剂[上海沪联生物药业(夏邑),含45%咪鲜胺];氟硅唑乳油(山东省青岛瀚生生物科技股份有限公司,含40%氟硅唑);多抗·戊唑醇可湿性粉剂(陕西美邦药业集团股份有限公司,含10%多抗霉素、10%戊唑醇);代森锰锌可湿性粉剂(湖南农大海特农化有限公司,含80%代森锰锌);苯甲醚甲环唑水分散粉剂(先正达南通作物保护有限公司,含10%苯甲醚甲环唑);精甲·咯菌腈悬浮种衣剂(先正达南通作物保护有限公司,含3.75%精甲霜灵、2.5%咯菌腈);苯甲·嘧菌脂悬浮剂(先正达南通作物保护有限公司,含12.5%苯醚甲环唑,20%嘧菌脂)。以上试剂分别用无菌水稀释为1 250倍液、2 500倍液和5 000倍液备用。

1.2 方法

1.2.1 金线兰茎腐病病原菌分离与纯化 采用组织分离法。切取病植株病健交界的组织块接种于针刺造伤的无菌金线莲茎段或叶片上,然后置于润湿的无菌滤纸,于25 ℃、14 h·d-1光照条件下培养5～7 d。叶片发病后,再取病叶病健交界的组织块接种于PDA培养基,置于25 ℃下培养5～7 d,之后挑取边缘菌丝进行2～3次纯化继代,直至获取性状稳定的纯化菌株。金线莲无菌苗诱导与继代方法见罗庆国等[14]的方法。

1.2.2 金线兰茎腐病病原菌形态学观察 参照王培育等[15]的方法。将纯化菌株培养7 d后,挑取菌块于显微镜(Olympus BX53)10倍与40倍物镜下拍照。利用血小板计数器计算孢子浓度。

1.2.3 金线兰茎腐病病原菌分子鉴定 参照文献[15],利用CTAB法提取纯化后的菌株总DNA。参照文献[16],利用真菌通用ITS引物ITS1(5′-GAGTTTGATCCTGGCTCA-3′)及ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)进行 PCR 扩增。参照文献[17],利用多肽链延伸因子EF-1α(elongation factor-1α)基因序列引物EF1T(5′-ATGGGTAAGGAGGACAAGAC-3′)和EF2T(5′-GGAAGTACCAGTGATCATGTT-3′)进行PCR扩增。20 μL PCR反应体系为: 2×Taq预混液10 μL,10 μmol·L-1上下游引物各1 μL,1 μL菌株DNA,双蒸水补至20 μL。PCR反应条件: 94 ℃预变性5 min; 95 ℃变性20 s, 根据引物温度退火20 s, 72 ℃延伸30 s,设40个循环;最后72 ℃延伸6 min。 1%琼脂糖电泳,回收500 bp左右条带,送铂尚生物技术有限公司测序。 利用GenBank数据库比对测序结果。

利用MEGA 6.0软件,以已知镰刀菌的ITS序列及EF-1α序列为参照,分别采用邻接法(neighbor-joining method, NJ)构建进化树。参比的ITS序列包括尖孢镰刀菌:FLR11(MK370694.1)、WZ-248(MN856369.1)、WZ-175(MN856309.1)和MR2934(MN709613.1);木贼镰刀菌(F.equiseti):NX2-1(MK764999.1);朗氏镰刀菌(F.langsethiae):CBS 113234(NR_121214.1);茄镰刀菌(F.solani):CBS 140079(NR_163531.1);禾谷镰刀菌(F.graminearum):SN34(MH782580.1)。参比的EF-1α序列包括尖孢镰刀菌西瓜专化型 (F.oxysporumf.sp.niveum):150523(MN689546);尖孢镰孢菌芝麻专化型(F.oxysporumf.sp.sesami):FS11719a(MN417191);尖孢镰刀菌番茄专化型(F.oxysporumf.sp.lycopersici):F79(KC831768)、F41(MH587166);F.oxysporumf.sp.opuntiarum:FuO319(KC196120)、DB18AGO01(MT450439);轮枝镰孢菌(F.verticillioides):FVB8(KC599244)、 K311(KF562131);层出镰刀菌(F.proliferatu):DI19(KF993985)、259(KC584812);亚粘团镰孢菌(F.subglutinan):OS12(JX867944);禾谷镰刀菌:CBS130959(JX118859)。

1.2.4 尖孢镰刀菌致病性分析 参照文献[15],用4 mm打孔器取培养7 d的病原菌平板菌落的边缘菌块,用无菌水配置孢子浓度为0.9×109个·mL-1的菌液。吸取2 μL接种于针刺或不针刺叶片表面,置于25 ℃、14 h·d-1光照条件下培养5～7 d后观察拍照。根据病斑与叶面积比值计算病情指数,按10%～100%分为1～10级。试验设3次重复。

1.2.5 尖孢镰刀菌防治药剂筛选 参照文献[18],用4 mm打孔器取培养7 d的病原菌平板菌落的边缘菌块接种于PDA平板中央。利用4 mm打孔器以十字交叉法打孔平板,每孔分别注射化学药剂1 250倍液、2 500倍液、5 000倍液各50 μL,以无菌水为对照,3次重复。培养7 d后,根据抑菌圈大小计算抑制率。

2 结果与分析

2.1 金线兰茎腐病病原物的分离纯化

于永安市上坪乡获得1株金线兰茎腐病发病植株。病株叶片褐化萎蔫,布满黄白色菌丝,植株茎部水渍化,严重时仅余叶鞘(图1)。于无菌条件下剪取发病植株病健结合部位的组织块2～3 mm2,接种于针刺创伤无菌叶片与茎部表面。接种7 d后可见接种部位水渍状褐化,发病症状与田间一致。叶片接种部位呈现水渍状褐化并生长出放射状菌丝(图2A),茎部从接种部位开始呈水渍状褐化并上下漫延,可致全株干枯(图2B)。将无菌叶片病健结合部位的组织块置于PDA培养基,经2～3次纯化培养获得ASP01菌株。

A.叶部;B.茎部。图1 金线兰茎腐病发病株症状Figure 1 Symptoms of A.roxborghil stem rot

A、C为接种0 d;B、D为接种7 d。 图2 金线兰茎腐病组织接种的发病症状Figure 2 Symptoms of A.roxborghil inoculated with stem rot tissue

2.2 金线兰茎腐病病原物菌株的鉴定

2.2.1 形态学特征 ASP01菌株接种7 d后,白色絮状致密菌丝布满6 cm PDA平板(图3A、3B)。菌落呈突起状,紫红色(图3A、3B)。菌丝宽2～6 μm,布满油状微粒(图3C)。产孢细胞单生呈瓶状(图3C),小型分生孢子着生于单生瓶梗上(图3D),单胞,长卵圆形,无隔膜,长2～8 μm,宽2～3 μm(图3E),在瓶梗顶端聚成团状(图3D);大型分生孢子镰刀形,呈双生聚集于单生瓶梗上(图3D),少许弯曲,具隔膜,多为3隔,长25～30 μm,宽3～5 μm(图3F);厚垣孢子尖生或顶生,球形,表面光滑无突起,直径4～7 μm(图3C)。

A.菌落正面(7 d);B.菌落背面(7 d);C.菌丝、厚垣孢子及产孢细胞;D.小型分生孢子及大型分生孢子的着生形态;E.小型分生孢子;F.大型分生孢子与小型分生孢子。线段代表20 μm。图3 ASP01菌株的形态特征Figure 3 Morphological characteristics of strain ASP01

2.2.2 分子鉴定 用真菌ITS序列的通用引物进行PCR扩增并测序,获得该菌株的ITS序列长度为525 bp,登录号为ON055851.1。通过与已知镰刀菌属菌株ITS序列构建进化树可见,ASP01与尖孢镰刀菌菌株聚为一类,而与木贼镰刀菌、朗氏镰刀菌、茄镰刀菌及禾谷镰刀菌的遗传距离较远(图4)。

图4 ASP01菌株的ITS序列进化树Figure 4 Phylogenetic tree of strain ASP01 based on ITS sequences

用EF-1α序列引物进行PCR扩增并测序,获得该菌株的EF-1α序列长度为689 bp,登录号为OQ632817。通过与已知镰刀菌属EF-1α序列构建进化树可见,ASP01与F.oxysporumf.sp.opuntiarum聚为一类,且与尖孢镰刀菌其他专化型遗传距离较近,而与镰刀菌其他种的遗传距离较远(图5)。

图5 ASP01菌株的EF-1α序列进化树Figure 5 Phylogenetic tree of strain ASP01 based on EF-1α sequences

综上所述,将ASP01菌株鉴定为尖孢镰刀菌。

2.3 金线兰茎腐病病原物的致病性分析

2.3.1 不同接种方式对ASP01致病力的影响 针刺造伤与无针刺造伤对APS01致病性的影响见图6。从图6可见,接种7 d后,无针刺造伤叶片未表现病症,而针刺造伤叶片表现出明显的水渍化与叶片失绿,接种无菌水的叶片均不发病(图6)。以上表明,物理创口加速尖孢镰刀菌对叶部的感染。

图6 不同接种方法下ASP01菌株的致病性Figure 6 Pathogenicity of APS01 with different inoculation methods

2.3.2 ASP01对不同金线莲种质的致病性差异 为比较ASP01对不同金线莲种质的致病性差异,使用不同种质金线莲无菌叶片接种ASP01孢子液,以接种无菌水为对照。接种7 d后可见,ASP01对所有参试金线莲种质致病(图7)。其中,滇南开唇兰、福建小圆叶、红霞病情指数较高,分别为10.00、9.95和4.69,而福建尖叶与台湾银线兰病情指数较低,分别为0.95和0.72(表1)。

表1 ASP01对金线莲种质的病情指数比较Table 1 Disease index of different A.roxburghii germplasms inoculated with APS01

2.3.3 ASP01对不同兰科种质的致病性差异 为进一步了解ASP01对兰科其他植物的致病情况,在铁皮石斛、姬蝴蝶兰以及墨兰无菌叶片上接种ASP01菌液,以接种无菌水为对照。接种7 d后(表2),铁皮石斛及墨兰的接种点无明显扩展,表现较强抗性,但姬蝴蝶兰则以接种点为中心呈水渍化扩散,表明ASP01可侵染姬蝴蝶兰(图8)。

表2 ASP01对兰科种质的病情指数比较Table 2 Disease index of different orchid germplasms inoculated with ASP01

图8 ASP01对兰科种质的致病性Figure 8 Pathogenicity of APS01 to different orchid germplasms

2.4 金线兰茎腐病病原物的防治药剂筛选

8种药剂对ASP01菌株生长的抑制效果见表3。咪鲜胺水乳剂抑制效果最佳,当稀释倍数为5 000倍时,其抑菌率可达93.83%,当稀释倍数为2 500倍时,抑菌率可达100.00%(表3、图9B)。氟硅唑乳油抑菌效果仅次于咪鲜胺,当稀释倍数为1 250倍时,抑菌率可达87.65%(图9C)。精甲·咯菌腈悬浮种衣剂、苯甲醚甲环唑水分散粉剂、苯甲·嘧菌脂悬浮剂在稀释浓度为1 250倍时,抑菌率可达75.31%～80.25%,当浓度下降时其抑菌效果也显著下降(图9F～9H)。甲霜·恶霉灵水剂、多抗·戊唑醇可湿性粉剂以及代森锰锌可湿性粉剂对ASP01生长抑制效果效差(图9A、9D、9E),在1 250倍稀释倍数下,其抑菌率仅在9.88%～22.22%之间。

表3 不同药剂对ASP01菌株的抑菌效果1)Table 3 Inhibition effect of different fungicides on ASP01

A.甲霜·恶霉灵水剂;B.咪鲜胺水乳剂;C.氟硅唑乳油;D.多抗·戊唑醇可湿性粉剂;E.代森锰锌可湿性粉剂;F.苯甲醚甲环唑水分散粉剂;G.精甲·咯菌腈悬浮种衣剂;H.苯甲·嘧菌脂悬浮剂;I.无菌水(对照)。以上十字交叉孔按逆时针从3点钟方向依次注入0、5 000倍、2 500倍及1 250倍药剂。图9 不同药剂对ASP01菌株的抑菌效果Figure 9 Inhibition effect of different fungicides on ASP01

3 讨论

茎腐病是金线莲种植中最为常见的病害之一,发病速度快、范围大,在防治上具有较大的难度[12]。在种植的全过程均可见该病的发生,但种植初期及种植5～6个月后发生率较高。尤其是种植初期,因出瓶、洗苗等一系列操作极易造成幼苗机械损伤,从而使该病高发。赵云青等[12]与路梅等[11]分别分离了金线莲茎腐病致病菌株尖孢镰刀菌,ASP01的形态特征与致病表现与前者较为接近,表现为接种5～7 d可见茎部发病,进而导致全株萎蔫水渍化。本试验中,利用发病株组织块接种无菌植株,从而快速分离得到茎腐病致病菌株ASP01。此方法可快速排除非致病菌的干扰,有效减少分离致病菌株的工作量,已在文心兰软腐病[18]与褐斑病[15]的分离中得到应用。尖孢镰刀菌是研究最为密集的地下真菌病原物之一,可通过其自身的一系列酶促作用降解植物细胞壁而进入植物体内。最常见的方式为该真菌通过根尖、根毛、伸长区以及缺口进入根表皮层后,通过细胞间隙进入维管组织。这个过程因植株本身的抗性不同而长短不一,最快2 d可到达细胞间隙,而具有抗性的植物在侵入位点可产生木质化或木栓化的细胞壁,到达根皮层需要8 d或者更长,并在到达维管组织前受到抑制[19-20]。本试验中,ASP01菌株可快速侵入具有机械损伤的叶片部位,而没有机械损伤的叶片则表现为不发病或者发病期延长至7 d以上。因此,在种植过程中避免虫害、种植、栽培管理等操作造成机械损伤是防止该病高发的一个重要技术手段。

尖孢镰刀菌可为害包括金线莲、香荚兰(Vanillafragrans)、建兰(C.ensifolium)、蝴蝶兰、石斛等多种兰科植物[11,12,21-25],但不同生理小种对兰科植物致病性差异较大[22]。通过ITS序列进化树分析显示,ASP01菌株与分离自福建三明与龙岩地区的建兰茎腐病的尖孢C9与C11菌株[23],但与分离自福建松溪与诏安的铁皮石斛茎腐病FJDO-1菌株遗传距离较远[24],表明尖孢镰刀菌在不同区域与寄主间存在较高的多样性。通过进一步利用EF-1α序列构建进化树分析发现, ASP01菌株与F.oxysporumf.sp.opuntiarum专化型聚为一类。F.oxysporumf.sp.opuntiarum专化型仅见报道于意大利的蟹爪兰(Schlumbergeratruncata)[26]与金琥(Echinocactusgrusonii)[27],国内还未见相关报道,而APS01菌株是否属于该专化型仍有待于进一步的鉴定。本研究中,对福建省种植最多的5个金线莲栽培品种进行了致病性测试,包括亲缘关系较远的滇南开唇兰与台湾银线兰。致病性测试表明,ASP01菌株对所有参试品种致病,但台湾银线兰与福建尖叶的病情指数相对较低,表明可通过育种来改良金线莲的抗茎腐病特性。在兰科其他植物的接种中,铁皮石斛及墨兰对ASP01具有较强抗性,表明尖孢镰刀菌具有一定的专化性,这些兰科植株中存在相应的防御机制。

本研究对ASP01菌株防治药剂进行筛选表明,咪鲜胺水乳剂、氟硅唑乳油以及精甲·咯菌腈悬浮种衣剂、苯甲·嘧菌脂悬浮剂、苯甲醚甲环唑水分散粉剂均可以达到较好的抑菌效果,而甲霜·恶霉灵水剂、多抗·戊唑醇可湿性粉剂、代森锰锌可湿性粉剂的抑菌效果差。黄鹏等[25]对建兰的茎腐病防治表明,咪鲜胺、苯醚甲环唑抑菌效果较好,本研究与该结果较为接近。邵清松等[13]对金线莲的茎腐病防治表明,戊唑醇乳油效果最佳、其次为腈菌唑和福星乳油,本研究与该结果不同,这可能与所分离获得的尖孢镰刀菌生理小种不同有关。