miR-296-3p在心房颤动病人血清中的表达水平及其临床意义

薛 睿,丁 莉,任 明

在心律失常类疾病中,心房颤动发病率逐年上升,目前已迅速成为世界范围内的医学问题[1-2]。心房颤动的病理机制较复杂,与多种因素有关[3-4],如心房结构重构、电重构、炎症、自主神经系统功能障碍和氧化应激等。微小核糖核酸(microRNA,miRNA)是非编码RNA家族的一员,长度为18～25个核苷酸,通过其转录后调节影响基因表达调控,从而介入生理过程及病理进展中[5]。目前,miRNAs已证实与心房颤动病理过程相关。Li等[6]研究发现,miR-10a通过介导转化生长因子(TGF)-β1/Samds信号通路抑制心房颤动导致心肌纤维化和成纤维细胞增殖。Lv等[7]研究发现,过表达miR-27b-3p通过靶向Wnt3a调控Wnt/catenin信号通路,可减轻心房颤动大鼠心房纤维化。虽已证实多种miRNAs与心房颤动发生相关,但关于miR-296-3p在心房颤动中作用的报道较少。本研究通过检测miR-296-3p在心房颤动病人血清中的变化,与影响心房颤动发生的临床危险因素进行分析,探究miR-296-3p的潜在靶基因,通过miR-296-3p在心房颤动中的作用,评估miR-296-3p作为心房颤动病理进展的生物学标志物的潜力。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取2020年6月—2021年6月于我院心内科住院治疗的心房颤动病人50例作为心房颤动组,选取同期于我院体检中心进行体检的健康志愿者15名作为健康对照组。根据《美国心房颤动治疗指南》[8]将心房颤动组病人分为阵发性心房颤动组(13例)、持续性心房颤动组(19例)、永久性心房颤动组(18例)3个亚组。所有受试者均知情同意并签署知情同意书。本研究通过医院伦理委员会审查。

1.2 纳入与排除标准

1.2.1 纳入标准 病人年龄30～70岁,心电图或24 h动态心电图(holter)证实心房颤动者。

1.2.2 排除标准 心房颤动病史不明、近期感染、自身免疫病、原发性胆汁性肝硬化、慢性膀胱疼痛综合征、结缔组织病、严重肾功能不全、恶性肿瘤、阿尔茨海默病、帕金森综合征及其他特殊状态中的心房颤动(妊娠期心房颤动、急性心肌梗死并发心房颤动、肥厚型心肌病并发心房颤动、甲状腺功能亢进并发心房颤动、外科手术后心房颤动)

1.3 主要试剂 焦碳酸二乙酯(DEPC)购自日本TaKaRa公司,Trizol氯仿(分析纯)购自日本TOYBO公司,荧光定量聚合酶链式反应(PCR)试剂盒购自日本TOYBO公司,cDNA合成试剂盒购自日本TaKaRa公司,二辛可宁酸(BCA)蛋白质分析试剂盒、高灵敏化学发光(ECL)检测试剂盒均购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司。

1.4 实验室检测 采集心房颤动病人清晨空腹肘静脉血4 mL,离心后(根据RNA提取试剂盒说明进行)-80 ℃存放备用。①采用罗氏全自动生化仪(Roche Cobas6000)检测低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、超敏C反应蛋白(hs-CRP)、血清总胆固醇(TC)、血肌酐(Cr)、三酰甘油(TG)、N末端B型脑钠肽前体(NT-proBNP)水平。②采用STAGO全自动血凝检测仪(法国STAGO CS-1300)检测血清D-二聚体水平。③采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测miR-296-3p mimic抑制SCN5A的效果,按miRNeasySerum/Plasma Kit试剂盒操作说明书提取总RNA,采用260 nm或280 nm处吸光度值(OD)对RNA的浓度和纯度进行检测,通过反转录试剂盒进行反转录实验后再测定miR-296-3p Ct值,计算miR-296-3p在各组样本中的表达水平(内参照为U6),取3次重复实验的平均值。④采用蛋白免疫印迹(Western Blot)法检测miR-296-3p mimic抑制SCN5A的效果,采用RIPA裂解缓冲液提取细胞,BCA法检测蛋白浓度,取上样缓冲液与样品混合并置于95 ℃变性10 min;电泳分离蛋白,转到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜,置于5%脱脂奶粉的封闭缓冲液中,封闭2 h。将SCN5A抗体(1∶500),GAPDH抗体(1∶1 000)加入至PVDF膜,GAPDH为内参;4 ℃过夜。弃一抗,加入1∶1 000稀释的辣根过氧化物酶标记二抗,室温孵育1 h;弃二抗,ECL化学发光剂显色,暗室下显影。⑤采用双荧光素酶报告基因实验检测转录因子和其靶启动子中的特异顺序,根据TargetScan(http:// www.targetscan.org)预测的miR-296-3p在SCN5A的3′-UTR区域具有的潜在结合位点,构建SCN5A野生型3′-UTR荧光素酶报告基因质粒wt-SCN5A及其突变型报告基因质粒Mut-SCN5A;将miR-NC或miR-296-3p mimics以及wt-SCN5A或Mut-SCN5A共转染到人胚胎肾HEK293细胞中;转染24 h后,加入1×被动裂解液裂解(PLB)15 min,收集裂解液;将植物无色花青素还原酶(LAR)底物100 μL加入到含有20 μL裂解液的EP管中,酶标仪读取Renilla荧光素酶的荧光值;加入终止试剂100 μL,立即读取firefly荧光素酶荧光值,用比值计算样本荧光强度[9]。

2 结 果

2.1 健康对照组与心房颤动组一般资料比较 两组高血压病史、风湿性心脏病病史、左房内径、左室射血分数(LVEF)以及血清LDL-C、Cr、NT-proBNP、hs-CRP、D-二聚体水平、血清miR-296-3p表达比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。详见表1。

2.2 心房颤动亚组间miR-296-3p表达水平比较 心房颤动亚组间miR-296-3p表达水平比较,阵发性心房颤动组<持续性心房颤动组<永久性心房颤动组,两两比较差异均有统计学意义(P<0.05)。详见表2。

表2 心房颤动亚组间miR-296-3p的表达水平比较(±s)

2.3 心房颤动病人血清miR-296-3p表达水平与一般资料的Pearson分析 采用Pearson相关分析法分析心房颤动病人血清miR-296-3p的表达水平与一般资料的相关性,结果显示,心房颤动病人miR-296-3p表达水平与年龄、左房内径呈正相关(r值分别为0.293,0.422,P<0.05)。详见表3。

表3 心房颤动病人血清miR-296-3p表达水平与一般资料的Pearson相关分析

2.4 TargetScan预测miR-296-3p在SCN5A的3′-UTR潜在的结合位点 采用TargetScan(http://www.targetscan.org)预测miR-296-3p的潜在靶基因,结果显示,SCN5A的3′-UTR区域存在位点与miR-296-3p形成互补结合(见图1),表明SCN5A是miR-296-3p的潜在靶基因。且TargetScan预测结果已显示SCN5A的3′-UTR区域存在位点与miR-296-3p形成互补结合,将转染miR-NC或miR-296-3p以及构建的SCN5A野生型3′-UTR荧光素酶报告基因质粒wt-SCN5A或突变型报告基因质粒Mut-SCN5A共转染进人胚胎肾HEK293中,然后进行双荧光素酶报告基因实验检测miR-296-3p对wt-SCN5A质粒及Mut-SCN5A质粒荧光素酶活性的影响,结果显示,不同浓度的miR-296-3p均可直接靶向作用于SCN5A的3′-UTR区域(见图2)。

图1 TargetScan预测miR-296-3p在SCN5A的3′-UTR有潜在的结合位点

与miR-NC比较,＊ P<0.01。图2 不同浓度miR-296-3p转染后荧光素酶活力检测结果比较

2.5 qRT-PCR检测miR-296-3p mimic抑制SCN5A的效果 不同浓度的miR-296-3p mimic均可结合SCN5A的3′-UTR进而抑制SCN5A的表达。详见图3。

与miR-NC比较,＊ P<0.05,# P<0.01。图3 qRT-PCR检测不同浓度miR-296-3p mimic抑制SCN5A mRNA表达比较

2.6 Western Blot检测miR-296-3p mimic抑制SCN5A的效果 不同浓度的miR-296-3p mimic都可结合SCN5A的3′-UTR进而抑制SCN5A的蛋白表达水平。详见图4、图5。

与miR-NC比较,＊ P<0.05,# P<0.01。图4 Western Blot检测不同浓度miR-296-3p mimic抑制SCN5A蛋白表达比较

图5 Western Blot检测不同浓度miR-296-3p mimic抑制SCN5A蛋白表达条带图

3 讨 论

心房颤动的疾病诱因具有复杂性及多样化,在可能导致心房颤动发展的潜在因素中,miRNAs已经证实与其发病机制相关。研究显示,多种miRNAs参与心律失常等疾病的发生,如miRNA-155[10]、miRNA-320[11]等。Zhang等[12]研究发现miR-122可能通过抑制细胞外调节蛋白激酶(ERK)的激活促进心房颤动心肌细胞凋亡;Ling[13]研究发现,在心房颤动病人中miR-499显著上调,导致SK3下调,从而参与心房颤动的电重构。在心肌纤维化病人血清中miR-296表达升高[14],但是miR-296与心房颤动是否具有相关性尚未明确。本研究检测到,在临床心房颤动病人血清中miR-296-3p的表达水平呈明显升高状态,并和年龄、左房内径呈正相关。进一步对导致心房颤动危险因素(年龄、冠心病、风湿性心脏瓣膜病、高血压、NT-proBNP、LVEF等)进行调整后,miR-296-3p的表达水平依旧和左房内径呈正相关,且miR-296-3p的表达水平和左房内径均伴随心房颤动持续时间的增加而增大。通过以上结果可知,miR-296-3p可能与心房重构有关。本研究通过TargetScan预测及双荧光素酶报告基因实验证实SCN5A是miR-296-3p的潜在靶基因,miR-296-3p可直接与相关基因SCN5A的3′-UTR区域相结合[15]。SCN5A基因负责编码人类主要心脏钠离子通道蛋白的ɑ亚单位(Nav1.5),并参与和维持心肌动作电位的形成,近年来,随着分子生物学和遗传学的发展与应用,临床心脏病学研究发现,扩张型心肌病、心房颤动和心脏传导疾病的综合征等均与SCN5A基因突变导致的Nav1.5结构的异常有关[16]。有研究显示,SCN5A基因多样性与心房颤动发生相关,此外,饮酒和高血压也会影响SCN5A基因的多态性[17]。结合以往研究结果,本研究通过qRT-PCR法和Western Blot法检测发现,miR-296-3p可调控SCN5A的mRNA和蛋白表达,提示miR-296-3p可能通过调控靶基因SCN5A参与心房颤动的发生。

综上所述,本研究结果显示,miR-296-3p在心房颤动病人血清中的表达水平明显升高,并与左心房内径及心房颤动持续时长有关,miR-296-3p可负调控SCN5A表达,初步评估了miR-296-3p成为心房颤动新靶点的可能性。但是miR-296-3p调控SCN5A能否对心房电重构和解剖结构重构发挥逆转作用仍需进一步研究。