基于网络药理学探讨抗病毒颗粒对甲型流感作用机制及炎症因子的影响*

张燕 王瑞琪 韦丽妮 曹志文 雷倩 赵宁 李立#

（1 中国中医科学院 北京 100700；2 中医临床基础医学研究所 北京 100700）

甲型流感病毒（Influenza A Virus, IAV）是最容易发生变异的流感病毒之一，且致病性高，对人类健康和全球公共卫生造成严重威胁。抗病毒颗粒（KBDG）由中医经典名方“白虎汤”（《伤寒论》）、“菖蒲郁金汤”（《温病全书》）和“清瘟败毒饮”（《疫疹一得》）加减化裁而来，组方包括板蓝根、地黄、广藿香、连翘、石膏、芦根、石菖蒲、郁金、知母9 味中药，具有清热祛湿、凉血解毒的功效，临床上常用于病毒感染性疾病[1]，对于流行性感冒也有较好的疗效[2]。有研究发现，KBDG 对甲型流感病毒FM1 株感染小鼠有较好的抗病毒、解热和抗炎作用[3]，但具体机制仍不明确。

网络药理学可整体化、网络化地分析生物信息并预测药物靶点，是阐明中药潜在治疗机制的有效方法[4]。本研究通过网络药理学预测KBDG 治疗甲型流感的主要活性成分、潜在靶点和信号通路，解析其可能的分子机制，并进行体内实验初步验证，旨在揭示KBDG 对甲型流感的保护机制。现报道如下：

1 资料与方法

1.1 KBDG 化学成分及作用靶点获取 通过TCMSP（https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）[5]查询KBDG 中药物板蓝根、地黄、广藿香、连翘、石膏、芦根、石菖蒲、郁金、知母的化学成分（石膏主要成分为硫酸钙和无机盐，无法查询[6]），并以口服利用度（OB）≥30%、类药性（DL）≥0.18 为条件进行初步筛选，获取活性成分及其作用的蛋白质靶点。使用UniPort 数据库（https://www.uniprot.org/）获得作用靶标蛋白所对应的基因名。

1.2 甲型流感相关靶点基因获取 在GeneCards数据库（https://www.genecards.org/）、DisgeNet 数据库（https://www.disgenet.org/）、TTD 数 据 库（http://db.idrblab.net/ttd/）和DrugBank 数据库（https://go.drugbank.com/）中获取“Influenza A Virus Infection”相关靶点基因。

1.3 KBDG 治疗甲型流感关键靶点获取 运用Draw Venn Diagram 在线工具对KBDG 的潜在作用靶点与甲型流感相关靶点取交集，交集基因即为KBDG 治疗甲型流感的关键靶点。

1.4 关键靶点蛋白互作网络构建 将关键靶点提交至STRING 11.5 数据库构建蛋白互作网络（PPI），通过Cytoscape 3.7.2 软件绘制图。使用软件中MCODE 插件对PPI 网络进行模块分析,得到潜在蛋白质功能模块，并根据其参与的生物学进程分析其功能。利用CentiScaPe 2.2 Menu 插件根据靶点的网络拓扑参数，包括介度（Betweenness）、紧密度（Closenesss）及连接度（Degree），进一步筛选PPI 网络中的核心靶点。

1.5 GO 与KEGG 通路富集分析 将核心靶点录入DAVID 数据库（https://david.ncifcrf.gov/）进行富集分析，设置筛选条件为P＜0.05，分别选取GO 分析中的生物学过程（BP）、细胞组成（CC）及分子功能（MF）中P值排名前10 位的条目，及KEGG 信号通路中P值排名前20 位的通路进行展示。

1.6 中药-活性成分-关键靶点-通路-疾病网络构建 利用Cytoscape 3.7.2 软件构建中药-活性成分-关键靶点-通路-疾病网络，并计算每个节点的Degree 值。

1.7 实验验证

1.7.1 动物与病毒 SPF 级BALB/c 雌性小鼠48只，6～8 周龄，体质量（16±2）g，由中国科学院微生物研究所提供（批准号：202010002）。甲型流感病毒A/PR/8/34 H1N1 株由中国科学院微生物研究所提供并保存。

1.7.2 仪器与试药 Avanti J-25I 超速低温离心机（美国BECKMAN），MH-1 型微量震荡器（江苏海口市牒麟医用仪器厂生产），包埋机（美国Thermo Fisher 公司），切片机（美国Thermo Fisher 公司），CKX53 倒置光学显微镜（上海中庸检验设备有限公司），SpectraMax iD5 型多功能酶标仪（美谷分子仪器有限公司）。抗病毒颗粒（9 g×10 袋/盒、无蔗糖，四川光大制药有限公司），磷酸奥司他韦胶囊（达菲）（75 mg×10 粒/盒，意大利Delpharm Milano S.r.l 生产，上海罗氏制药有限公司分装），4%多聚甲醛，异氟烷（瑞普〈天津〉生物药业有限公司），多因子检测试剂盒（HyClone R&D SYSTEMS）。

1.7.3 分组及给药 将小鼠随机分为空白组、模型组、阳性药组、KBDG 组，每组12 只，分别于第4 天、第7 天各取材6 只。空白组和模型组给予等容积的双蒸水溶液灌胃，阳性药组给予奥司他韦混悬液20 mg/（kg·d）灌胃，KBDG 组给予KBDG 混悬液3 510 mg/（kg·d）灌胃。各组灌胃1 次/d，连续7 d。

1.7.4 造模及取材 小鼠适应性喂养3 d，空腹8 h后开始实验。除空白组外，其余三组小鼠用3%异氟烷麻醉，以15 个LD50 流感病毒液（A/PR/8/34 H1N1 株）滴鼻感染（35 μl/只）。感染后2 h 开始给药，每天1 次，连续7 d。第4、7 天取材，麻醉小鼠后，摘眼球取血，解剖摘取小鼠肺脏，用磷酸缓冲盐溶液（PBS）清洗表面血迹，滤纸吸干表面液体后置于4%多聚甲醛固定液中固定留存备用。

1.7.5 HE 染色观察与评价 肺组织样本用4%多聚甲醛溶液固定24 h 后，石蜡包埋切片，常规HE染色。采取双盲法对所有样本病理切片统一操作，并进行病理评分[7]。

1.7.6 多因子检测 选取网络药理学预测分析的关键靶点，同时具有抗炎或促炎功能的代表性因子进行酶联免疫吸附实验（ELISA）。采集各组小鼠外周静脉血，以1 200×g 离心12 min，每个样本吸取15 μl 血清，检测白细胞介素（IL）-2、IL-10、IL-6、IL-1β水平。

1.8 统计学方法 使用SPSS24.0 统计学软件对实验数据进行分析。正态分布的数据用（±s）表示，组间比较采用t检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 KBDG 的活性成分与靶点 通过TCMSP 数据库获取板蓝根、地黄、广藿香、连翘、知母、芦根、石菖蒲、郁金的活性成分，分别为板蓝根35 个、地黄2个、广藿香9 个、连翘18 个、知母12 个、芦根1 个、石菖蒲4 个、郁金3 个，合并去重后共获得抗病毒颗粒活性成分74 个。各药的作用靶点分别为板蓝根91 个、地黄31 个、广藿香162 个、连翘229 个、知母113 个、芦根31 个、石菖蒲82 个、郁金69 个，合并去重后共得到260 个药物作用靶点。见表1。

表1 KBDG 各药味化学成分和靶点数（个）

2.2 甲型流感相关靶点 从GeneCards 数据库获得甲型流感靶点1 323 个，在DrugBank、DisgeNet和TTD 数据库补充相关靶点，分别得到18、117、4个靶点。合并4 个数据库靶点信息并去重后获得1 379 个甲型流感相关靶点。将KBDG 药物靶点与甲型流感疾病靶点取交集，绘制韦恩图，得到109 个共同靶点。见图1。

图1 KBDG 靶点-甲型流感靶点韦恩图

2.3 药物与疾病关键靶点的获取和PPI 网络的构建 在STRING 11.5 平台构建109 个共同靶的PPI网络，利用CentiScaPe 2.2 Menu 插件根据靶点的网络拓扑参数筛选出包括AKT1、IL-1β、IL-6、肿瘤坏死因子（TNF）、IL-10 等在内的核心蛋白质30 个。见图2。根据MCODE 模块分析得到2 个模块，模块1包含54 个靶点，得分为44.34 分；模块2 包含12 个靶点，得分为3.636 分。见图3。

图2 KBDG 治疗甲型流感共同靶点与核心靶点的PPI 网络

图3 KBDG 治疗甲型流感关键靶点MCODE 模块分析

2.4 GO 和KEGG 富集分析 核心靶点GO 富集分析得到461 条目，其中BP 条目366 个，涉及基因表达的正向调控、RNA 聚合酶Ⅱ启动子转录的正向调控、脂多糖介导的信号通路等；CC 条目30 个，与大分子复合物、胞外区、细胞外间隙、核质等有关；MF条目65 个，与酶结合、相同蛋白结合、转录因子结合相关。图4 展示各类别中排列前10 的条目。核心靶点KEGG 分析得到136 条信号通路，P值排名前20的信号通路涉及IL-17 信号通路、TNF 信号通路、Th17 信号通路等。见图5。

图4 KBDG 治疗甲型流感关键靶点GO 富集分析

图5 KBDG 治疗甲型流感关键靶点KEGG 富集分析

2.5 中药-活性成分-核心靶点-通路-疾病网络构建 KBDG 治疗甲型流感的活性成分、核心靶点、通路、疾病之间可以形成复杂且关系密切的网络。见图6。

图6 KBDG 治疗甲型流感中药-活性成分-关键靶点-通路-疾病网络

2.6 实验验证

2.6.1 小鼠肺组织外观及病理切片HE 染色 空白组小鼠肺组织形态正常，病理显示肺泡大小结构正常，肺间质无增厚、无炎症细胞浸润、无出血水肿。模型组小鼠肺外观可见明显肿胀充血，病理显示肺泡结构塌陷，肺间质明显增厚，肺泡和肺间质可见炎症细胞聚集成团，肺泡腔可见出血水肿；与模型组比较，阳性药组和KBDG 组的肺组织形态与肺泡结构病变程度均有所缓解，表现为可见较多结构较完整肺泡出现，肺间质充血水肿有所减轻，炎症细胞浸润减少，随着病程的延长，病理状态趋于改善，在第7天时，KBDG 组病理评分较模型组改善明细（P＜0.05）。见图7。

图7 各组小鼠肺组织外观、病理切片HE 染色（200×）及病理评分

2.6.2 小鼠血清中IL-2、IL-10、IL-1β、IL-6 的表达选取网络药理学预测分析的关键靶点IL-10、IL-1β、IL-6 及IL-2 因子，作为具有抗炎或促炎功能的代表性因子进行分析。治疗第4 天，模型组小鼠血清中IL-2、IL-10 表达均明显低于空白组（P＜0.05、P＜0.01），IL-6 表达高于空白组（P＜0.05）。阳性药组、KBDG 组的IL-2、IL-10 均高于模型组（P＜0.05、P＜0.01），KBDG 组IL-1β、阳性药组的IL-6 均低于模型组（P＜0.05）。治疗第7 天后，模型组小鼠血清中IL-1β、IL-6 明显高于空白组（P＜0.05）。阳性药组的IL-2、KBDG 组 的IL-2 及IL-10 明 显 高 于 模 型 组（P＜0.01、P＜0.05），阳性药组、KBDG 组的IL-6 明显高于模型组（P＜0.05）。见图8。

图8 KBDG 对甲型流感感染小鼠血清IL-2、IL-10、IL-1β、IL-6 的影响

3 讨论

流感是由流感病毒感染引起的一种具有高度传染性的急性病毒性呼吸道疾病，在世界范围内造成巨大的发病率和病死率。在引起人类疾病的3 种流感类型中，甲型流感由于对抗原变异具有高敏感性，是引起大流行的最主要类型。目前，甲型流感的主要防治手段是疫苗注射和神经氨酸酶抑制剂（NI），但存在病毒变异、毒株难以匹配、高耐药性等问题，此外，各种免疫调节剂和信号通路抑制剂也还处于临床前开发阶段，因此迫切需要寻找更多治疗甲型流感的替代药物。从分子水平上了解甲流相关细胞信号通路，有助于了解免疫病理学变化的原因，明确免疫调节干预措施和开发新的治疗药物。

甲型流感病毒流引起的季节性流感在中医学内被归属于“瘟疫”，也称“疫病、疫疠、毒气”。中医药能够调节机体免疫系统，缓解流感病毒引起的过度免疫反应，在甲流病毒引起的肺炎防治中具有独特优势。KBDG 是临床常用的治疗流感的中药复方制剂，对新发传染性疾病和新冠肺炎等疾病也具有潜在临床应用价值。为阐明KBDG 对甲型流感的保护作用及机制，本研究利用网络药理学方法获得该药的51个药物活性成分和作用于疾病的30 个核心靶点，构建药物-活性成分-核心靶点-通路-疾病网络。分析发现：槲皮素、豆甾醇、汉黄芩素等是KBDG 治疗甲型流感的有效成分，其中槲皮素可以提高存活率和肺指数抑制率、降低肺指数，对甲型H1N1 流感感染小鼠具有保护作用[8]，相关机制可能与阻断血凝素和神经氨酸酶活性位点、抑制病毒复制、影响免疫系统等有关。豆甾醇可以降低血凝素结合活性，抵抗H1N1 流感病毒感染[9]。汉黄芩素可以通过下调活性氧（ROS）水平，抑制巨噬细胞氧化应激，发挥减轻炎症反应的作用[10]。

针对GO 和KEGG 的分析结果提示，IL-17、TNF、Th17 等经典信号通路在KBDG 治疗甲型流感中发挥关键作用。研究发现，流感小鼠支气管肺泡灌洗液中IL-17，Th17 介质以及IL-17 反应性细胞因子和趋化因子的水平均升高[11]。IL-17A 是流感病毒诱导的肺功能受损和免疫病理学改变的常见和关键驱动因素[12]。TNF 基因多态性研究显示，TNF 基因的-376 显性模型AA+GA 与甲型流感（H1N1）的易感性有关[13]。

甲型流感病毒感染常引起患者全身促炎与抑炎细胞因子水平变化[14]。本研究发现，IL-1β、IL-6、TNF、IL-10 等是抗病毒颗粒治疗甲型流感的关键作用靶点。其中IL-1β、IL-6、TNF-α 等细胞炎症因子在甲型流感发病中具有重要作用，其表达水平与甲型H1N1 流感患者的疾病严重程度相关[15]。炎症基因IL-1β、IL-6 与促炎分子表型改变有关，参与IAV 感染和危重症形成[16]。IL-6 是感染甲流病毒患者危重症的标志[17]，其过量与流感患者的预后不良密切相关[18]。IL-2 可以向靶向甲型流感病毒的效应CD4+T细胞传递生存信号，促进记忆CD4+T 细胞形成，改善流感感染预后[19]。IL-10 是最有效的抗炎细胞因子，有助于改善免疫病理损伤[20]。本研究结果发现，KBDG 能有效缓解病毒引起的肺损伤，减轻机体的过度免疫反应，升高IL-2、IL-10 表达水平，抑制IL-1β、IL-6 表达，避免细胞因子风暴的发生。

综上所述，槲皮素、豆甾醇、汉黄芩素可能是KBDG 抗甲型流感的主要活性成分，KBDG 能够有效升高甲型流感小鼠血清中IL-2、IL-10 表达，抑制IL-1β、IL-6 表达，其机制可能与IL-17、Th17 信号通路等免疫通路有关，这一研究结果可为KBDG 的基础研究及临床应用提供思路和依据。