拷贝数变异测序在稽留流产遗传学检测中的应用

覃颖，毛锦江，钟文富

贵港市人民医院产科1、检验科2，广西 贵港 537100

稽留流产(missed abortion，MA)是指胚胎或胎儿已死亡，滞留在宫腔内未能及时自然排出者[1-2]。8%～15%的孕妇在妊娠早期会发生自然流产，大多数发生在孕早期(7～11周)[3-4]，近几年有增加趋势。导致稽留流产的原因众多，随着细胞遗传学技术的进步和对稽留流产遗传原因的长期研究，胎儿/胚胎染色体异常是稽留流产最常见的原因，约占75%，这种染色体异常是由于生殖细胞的遗传物质异常所致[3]。既往研究表明，育龄女性中有20%～30%的卵子和年轻健康男性中有6%～8%的精子存在染色体异常，通常是染色体数目异常[3]。拷贝数变异测序(CNV-seq)技术是采用一下代测序技术(NGS)检测大于0.2 Mb DNA 序列的结构变异，是一种从基因组的随机片段拷贝中平行测序大量短DNA 链的技术。基于NGS 正迅速发展，CNV-seq作为一种低深度全基因组测序，在产前诊断、流产、先天性异常或神经发育迟缓的患儿等临床检测染色体疾病中广泛使用[2，4]。本研究利用CNV-seq 技术检测对我院收治的稽留流产患者的绒毛/胎儿组织进行遗传学分析，以帮助确定病因，并提供遗传咨询，评估下一次妊娠的风险。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2020年1月至2021年12月在贵港市人民医院产科就诊的220例稽留流产患者的绒毛/胎儿组织，患者年龄17～46 岁。纳入标准：根据临床病史、实验室检查和经阴道超声检查诊断为稽留流产，所有稽留流产发生在胎龄6 至13 周之间，并接受流产物细胞遗传学相关检查的患者。排除标准：孕早期有不良接触史和服药史，生殖系统解剖结构异常，糖尿病，精神病和免疫系统疾病的患者。本研究已经医院医学伦理委员会批准，所有患者均于检查前签署知情同意书。

1.2 研究方法 清宫手术或药物流产终止妊娠排出的绒毛/胎儿组织，用0.9%氯化钠溶液多次漂洗去除母体血液及污染物后挑取样本，置于无菌容器中，4℃保存及运输，样本送至深圳华大临床检验中心进行检测。使用PCR 扩增产物够进行单链分离和环化反应，最终获得带有一个接头的单链环状DNA 文库。采用PCR-free建库方法建立单链环状DNA文库，利用华大自主测序平台MGISEQ-2000 进行测序，并利用测序仪自带的数据处理软件Zebracall 找到最终的CNV 结果。参考美国医学遗传学与基因组学学会(ACMG)、临床基因组资源中心(ClinGen)等相关指南共识及数据库对CNV进行解读判定。

1.3 统计学方法 应用SPSS25.0 软件进行数据统计分析。计数资料采用构成比(%)表示，组间比较采用χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CNV-seq检查结果 220例稽留流产患者进行其绒毛/胎儿组织经CNV-seq检查，成功检测215例，失败5例，成功率为97.73%(215/220)。检出异常染色体140例，占全部样本的65.12%(140/215)，检出正常染色体75例，占全部样本的34.88%(75/215)。异常染色体中，数目异常型113 例(80.71%，113/140)，其中三体型82 例(58.57%，82/140)，最常见。16 号、22 号、15 号、21 号和14 号三体发生率最高，7例为两条常染色体复合三体。三倍体18例(12.86%，18/140)，单体13例(9.29%，13/140)，主要见于X单体。嵌合体型13例(6.05%，13/215)；染色体节段缺失/重复14 例(6.51%，14/215)，见表1。

表1 流产胚胎染色体数目异常及类型(n=140)Table 1 Chromosome number abnormality and types of aborted embryos(n=140)

2.2 染色体嵌合体异常情况 本研究发现嵌合体13 例(6.05%)，其中，性染色体嵌合5例(包括X单体嵌合3 例)，常染色体三体嵌合8 例，分别为1 号和2 号和15 号复合三体嵌合1 例，21 单体嵌合1 例，2 号、6号、8号、10号、15号、16号三体嵌合各1例。

2.3 染色体拷贝数变异情况 本研究发现染色体片段缺失/重复14 例(6.51%)，其中5 例染色体大片段缺失重复和2例为微缺失微重复综合征为临床致病性变异，1例良性变异，6例临床意义不明确的变异，见表2。

表2 流产胚胎染色体拷贝数变异检测结果Table 2 Detection results of chromosome copy number variation of aborted embryos

2.4 孕妇年龄与染色体的关系 本研究中，孕妇年龄＜35 岁者共153 例，染色体异常95 例，检出率为62.09%；孕妇年龄≥35 岁者共62 例，染色异常体45 例，检出率为72.58%，其中年龄≥35 岁组染色体异常的发生率更高，但差异无统计学意义(χ2=2.137，P＞0.05)。

3 讨论

3.1 流产与染色体数目异常的关系 近年来，稽留流产的发病率逐渐升高，病因复杂多样，给孕产妇带来严重的心理和社会负担。研究表明胚胎或胎儿染色体异常是早期稽留流产最常见的原因，而染色体非整倍体改变是自然流产的重要原因[1，3]。本研究利用CNV-seq 对早期稽留流产患者的绒毛/胎儿组织进行检测，检测成功率为97.73%，检出染色体异常为140 例，染色体异常率为65.28%，与文献报道的基本一致[5]。染色体异常中以非整倍性为主，即染色体数目增加或减少，其中非整倍体113 例，占染色体异常的80.71%，除了1 号、3 号、5 号7 号和11 号染色体外，大多数染色体都存在非整倍体性，常染色体三体型占多数，占染色体异常的51.06%，与既往文献报道的结果没有区别，在大多数研究中，常染色体三体型发生率在33%～66%之间，但最常见的是50%左右[3]。本研究中16号、22号、15号、21号、14号染色体三体占比例最高，这5 条染色体三体占所有三体型的67%，都是比较小的染色体，容易发生非整倍体异常，大多数在早期妊娠中流产，活产儿中21 三体最常见，而大的常染色体1 至6 号染色体中的非整倍体是最不常见的。单体型13 例，主要为45,X，性染色体X 单体在流产儿和活产儿中都可见到，但性染色体三体在流产儿中不常见[1]。两条常染色体复合三体7 例，分别为9 号和16 号、7 号和15号、2 号和14 号、15 号和21 号、16 号和21号、14号和17号染色体复合三体各1例。本研究结果表明孕早期胚胎染色体异常是导致稽留流产的主要原因之一，染色体非整倍体是早期流产最常见的染色体异常。

3.2 稽留流产与染色体嵌合体的相关性 本次研究检测出嵌合体13 例，占染色体异常的9.29%，其中3例为X单体嵌合，性染色体嵌合2 例，常染色体三体嵌合8例。嵌合体是指含同时存在两种或两种以上核型的细胞系的个体。其发生机制主要是早期胚胎发育过程中有丝分裂和减数分裂错误，导致个体同时存在两个或多个细胞系[6-7]。1%～2%的胎盘组织(绒毛)可发现胎盘嵌合体。多数妊娠胎盘组织(绒毛)与胎儿的核型一致，但当存在限制性胎盘嵌合体(CPM)时，胎盘组织(绒毛)中可能存在几种不同比例的细胞系核型，多为染色体非整倍体，而胎儿核型无异常[3]。本研究中，研究的主要组织是绒毛膜的细胞滋养层，可能涉及或没有涉及胚外中胚层，很难评估嵌合体涉及胚胎外组织所占比例，以及是否与正常或异常的胎儿核型或母体细胞污染有关[3]。有研究认为，大多数胎盘嵌合体胎儿可以妊娠至足月，没有合并畸形或异常，但有些会导致宫内发育迟缓(IUGR)、早产、胎盘功能不全和流产。在健康人的各种组织(包括大脑、血液和皮肤)中，嵌合体的发病率很高，染色体嵌合体可能与包括精神疾病、自身免疫性疾病和先天性畸形等多种疾病有关[8]。

3.3 稽留流产与染色体CNV的相关性 研究表明，有些致病性的CNV与发育迟缓、智力障碍、特殊面容、多发畸形、癫痫等相关，有些含有重要基因片段的CNV缺失和重复可能导致胚胎发育畸形或死亡，但与稽留流产是否相关还需更多的研究来验证[9-10]。本研究中检出有临床意义染色体CNV 8 例(检出率为3.72%)，其中有5 例为大片段缺失和(或)重复，涉及大量的功能基因，为致病性变异，另外有2例分别为16号微缺失综合征和19 号微缺失综合征，缺失长度均在5 Mb 以下，1 例14 号长臂微重复为良性变异，这些微小变异常规G 显带染色体核型分析不能检测出的染色体异常。由此可见，对绒毛/胎儿组织进行拷贝数变异分析可提高染色体异常检出率，能够发现更多罕见的微缺失微重复综合征，为遗传咨询提供依据，指导再次妊娠。本研究检出临床意义不明确CNV 的病例6例，检出率为2.79%，这类病例CNV的结果解读与遗传咨询，需通过夫妇双方进行同种类型CNV-seq 检测以验证变异来源。若CNV是遗传性的，则临床指导意义较小，若为新发的变异，则临床指导意义较大，但仍需要考虑不完全外显和临床表型差异的影响[11]。

3.4 染色体异常与患者年龄的相关性 研究表明，胚胎染色体发生非整倍性改变随着年龄的增长呈升高趋势，在28～29岁时染色体非整倍性发病率最低，为25%，35岁后急剧上升，在45岁时达到90%的峰值[2，7]。从机制上讲，随着年龄的增加，卵细胞质量下降，卵细胞在有丝分裂和减数分裂过程中延滞，导致染色体的异常。本研究结果显示年龄≥35 岁组的染色体异常率高于年龄＜35 岁组，但差异并无统计学意义(P＞0.05)，发生这一现象的原因可能是本研究样本量较少，未来需要扩大样本进一步统计。

3.5 CNV-seq 技术的优势及临床意义 常规G显带染色体核型分析是检测染色体非整倍性和不平衡易位的金标准，但总体检测失败率为20%，当出现母体细胞污染时会导致假阴性结果。常规G 显带染色体核型分析仅能检测＞5 Mb 的染色体节段改变，且存在分辨率低、成本较低、细胞培养周期长等缺点。荧光原位杂交(FISH)、多重连接依赖性探针扩增(MLPA)和定量荧光聚合酶链反应(QF-PCR)等技术克服了传统细胞遗传学技术的一些缺点，但因其分辨率不高，未能对全基因组覆盖而在临床中受到限制[2-3]。随着下一代测序(NGS)技术的发展，CNV-seq 是一种高通量基因测序技术，具有周期短、分辨率高、通量高、成本低、只需要少量DNA、高诊断性能等特点。临床上特别是在仅有少量组织时，CNV-seq 可能是不够用于成功的细胞培养进行遗传学核型分析；或细胞培养失败时，CNV-seq 是核型分析的可行替代或补充方法，用于准确识别与流产相关的已知染色体原因，适用于研究流产的遗传学病因，具有相对较高的基因组分辨率和精确定量拷贝数的能力，可提高胚胎染色体异常的诊断率[2]。

综上，染色体数目异常是导致早期流产最常见的染色体异常。应用CNV-seq对流产物进行染色体检测为早期流产的遗传学检测提供更多的遗传信息，为稽留流产的病因和遗传咨询提供依据，具有很好的应用价值，对再次妊娠具有很好的指导意义。