益气活血药方对心肌缺血再灌注损伤模型大鼠氧化应激及线粒体能量代谢的影响※

黄小楼 平兰芝 谭晓波 王 惠 蔡 倩 郭书文△

(1.贵州中医药大学针灸推拿学院,贵州 贵阳 550025;2.北京中医药大学中医学院,北京 100029)

心肌缺血再灌注损伤是心力衰竭患者围手术期常见的并发症之一,不仅影响再灌注的治疗效果,还可加剧心力衰竭[1-2]。益气活血药方是由黄芪、当归、人参、川芎、三七等组成,是在经典方剂当归补血汤的基础上加味形成的治疗心系疾病的经验方剂[3]。前期研究表明,益气活血药方具有保护心脏作用,可促进心脏微血管形成,改善心肌细胞肥大,减轻心肌凋亡[4]。代谢组学研究也发现,益气活血药方可能通过转化生长因子β1(TGF-β1)/Notch信号调节心脏功能,在能量代谢上对心室重塑有一定改善,并对线粒体动力学相关蛋白有一定影响[5],但具体作用机制尚不明了。为进一步研究益气活血药方作用机制,本研究构建心肌缺血再灌注损伤大鼠模型,观察益气活血药方对实验大鼠心肌缺血再灌注损伤时线粒体功能和能量代谢的影响,探讨其对心肌保护作用,结果如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 无特定病原体(SPF)SD雄性大鼠50只,体质量(200±20)g,于北京中医药大学东直门医院中医内科学重点实验室SPF级实验动物房分笼饲养,均购于北京维通利华实验动物技术有限公司,生产许可证编号:SCXK(京)2016-0006。

1.2 实验药物 益气活血药方:由生黄芪、人参、当归、川芎、三七组成,按照2∶2∶1∶1∶1药量配伍[5],依据口服剂工艺制备,按处方比例称取中药材,加9倍量水,煎煮3次,每次2 h,共6 h,煎液过滤,浓缩,分装后灭菌备用,药材提供及制备均由中日友好医院药剂科完成;氯喹(自噬抑制剂,美国Sigma公司);注射用异戊巴比妥钠(上海新亚药业有限公司,国药准字H31021724)。

1.3 主要试剂及仪器 活性氧(ROS)、过氧化氢酶(CAT)、总抗氧化能力(T-AOC)检测试剂盒(上海酶联生物科技有限公司);三磷酸腺苷(ATP)检测试剂盒、超微量钠离子(Na+)-钾离子(K+)-ATP酶检测试剂盒、超微量钙离子(Ca2+)-ATP酶检测试剂盒(南京建成生物工程研究所);线粒体蛋白分离缓冲液(天津科维诺生物科技有限公司);磷酸盐缓冲液(PBS,中国上海碧云天生物工程研究所);ALC-V8型小动物呼吸机(上海奥尔科特生物科技有限公司);VevoTM2100高分辨率小动物超声成像系统(加拿大Visual Sonics公司);BX53生物显微镜(日本Olympus公司);Pheom Prox电子显微镜[复纳科学仪器(上海)有限公司]。

1.4 实验方法

1.4.1 实验分组 将50只SD大鼠随机分为假手术组、模型组、益气活血药组、氯喹组、益气活血药+氯喹组,每组各10只。

1.4.2 模型制备 除假手术组外,其余各组均采用左冠状动脉前降支结扎法构建心肌缺血再灌注损伤模型,1%注射用戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔麻醉,经口气管插管,连接小动物呼吸机行机械通气,监测导联心电图。于左侧胸壁第3～4肋间距离胸骨左缘约0.5 cm做切口,逐层钝性分离开胸,经左冠状动脉前降支进行结扎,缺血30 min后松开结扎线,以心肌缺血区恢复红润、ST段回落、T波恢复为再灌注成功的标志[6]。假手术组于左冠状动脉前降支穿线但不进行结扎,其余步骤同建模组。

1.4.3 给药方法 益气活血药组于造模后次日按8.2 g/(kg·d)予益气活血药液灌胃,氯喹组在造模前30 min腹腔注射10 mg/kg氯喹,造模后次日予2 mL无菌蒸馏水灌胃;益气活血药+氯喹组在造模前30 min腹腔注射10 mg/kg氯喹,造模后次日按8.2 g/(kg·d)予益气活血药液灌胃;模型组和假手术组均于术后次日给予2 mL无菌蒸馏水灌胃,各组均连续灌胃4周后进行下一步实验。

1.5 观察指标及方法

1.5.1 心肌组织病理 采用苏木素-伊红(HE)染色观察心肌组织病理变化。1%注射用戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠,麻醉生效后,颈椎脱臼法处死,解剖,取适量心肌均匀切成片,厚度约5.0 μm,置于包埋盒内,4%多聚甲醛中固定过夜,常规脱水,石蜡包埋,依次浸泡脱蜡,苏木素染色40 s,冲洗后置于伊红溶液染色3 s,自来水冲洗,冲洗后进行脱水和透明处理[7],随后使用中性树脂覆盖玻片进行封固。光学显微镜下观察心肌组织病理情况并采集图片,各组取10个样本。

1.5.2 心功能指标 采用超声检测心功能指标。1%注射用戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠,麻醉生效后,取左侧侧卧位,取胸骨旁长轴观,测量记录左室舒张末期内径(LVEDd)、左室收缩末期内径(LVESd),计算左室射血分数(LVEF)和左室短轴缩短率(LVFS),各组取10个样本。

1.5.3 心肌组织氧化应激指标 各组取新鲜心肌组织约200 mg,预冷0.9%氯化钠注射液中漂洗后,除去血液,采用手术剪将心肌组织块剪碎,转移至匀浆管中,制成10%的组织浆液,离心10 min,取上清液,检测心肌组织中ROS、CAT、T-AOC水平,各组取10个样本。

1.5.4 心肌细胞线粒体超微结构变化 各组取新鲜心肌组织约200 mg,浸入5%戊二酸溶液,经过固定,脱水,包埋,超薄切片,梓檬染色10 min,去二氧化碳的双蒸水清洗,醋酸铀染色30 min,双蒸水清洗,干燥,然后在电子显微镜下观察细胞线粒体超微结构变化情况并采集图片,各组取10个样本。

1.5.5 心肌细胞线粒体能量代谢指标 各组取大鼠新鲜心肌组织约200 mg,预冷0.9%氯化钠注射液中漂洗,将心肌组织块剪碎,转移至匀浆管中,制成10%的组织浆液,加入1 mg/mL线粒体蛋白分离缓冲液及1 mL 10%三氯醋酸(TCA),培养箱中常规孵育60 min,加入1 mL 10%TCA 终止反应,4 ℃离心15 min,取上清液采用超微量ATP酶测试盒检测大鼠心肌细胞中ATP Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶的水平变化,各组取10个样本。

2 结果

2.1 各组大鼠心肌组织病理变化情况 假手术组心肌纤维排列规律,肌丝清晰,无炎性改变,细胞形态正常,核膜完整,染色质分布均匀。模型组和氯喹组梗死边缘区结构不规则,肌纤维断裂、核碎裂,心肌细胞数量显著减少,肌细胞增粗,可见不同程度炎症细胞浸润。益气活血药组及益气活血药+氯喹组心肌排列较假手术组紊乱,可见炎症细胞带,但较模型组或氯喹组肌纤维略整齐,肌细胞略肿胀,胞浆内嗜酸性改变较明显。见图1。

图1 各组大鼠心肌组织病理变化情况(HE,×400)

2.2 各组大鼠心功能指标LVEDd、LVESd、LVFS、LVEF水平比较 与假手术组大鼠比较,模型组大鼠心功能指标LVEDd、LVESd均升高(P<0.05),LVFS、LVEF均降低(P<0.05)。与模型组比较,益气活血药组及益气活血药+氯喹组大鼠心功能指标LVEDd、LVESd均降低(P<0.05),LVFS、LVEF均升高(P<0.05),氯喹组LVEDd、LVESd、LVFS、LVEF与模型组比较差异均无统计学意义(P>0.05)。与益气活血药组比较,氯喹组及益气活血药+氯喹组大鼠心功能指标LVEDd、LVESd均升高(P<0.05),LVFS、LVEF均降低(P<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠心功能指标LVEDd、LVESd、LVFS、LVEF比较

2.3 各组大鼠心肌组织氧化应激相关指标ROS、CAT、T-AOC水平比较 与假手术组比较,模型组大鼠心肌组织ROS水平升高(P<0.05),CAT、T-AOC水平均降低(P<0.05)。与模型组比较,益气活血药组及益气活血药+氯喹组大鼠心肌组织ROS水平均降低(P<0.05),CAT、T-AOC水平均升高(P<0.05),氯喹组ROS、CAT、T-AOC水平与模型组比较差异均无统计学意义(P>0.05)。与益气活血药组比较,氯喹组及益气活血药+氯喹组大鼠心肌组织ROS水平均升高(P<0.05),CAT、T-AOC水平均降低(P<0.05)。见表2。

表2 各组大鼠心肌组织氧化应激相关指标ROS、CAT、T-AOC水平比较

2.4 各组大鼠心肌细胞线粒体超微结构变化情况 假手术组线粒体形态结构正常,呈椭圆形,双层膜清晰。模型组和氯喹组线粒体大小不一,内室肿胀,内嵴水肿、紊乱,甚至断裂消失。益气活血药组及益气活血药+氯喹组线粒体基质呈气球样改变,出现自噬泡,线粒体可见受损线粒体被自噬体吞噬,并与溶酶体融合。见图2。

图2 各组大鼠心肌细胞线粒体超微结构变化情况[比例尺(scale bar)∶1 μm]

2.5 各组大鼠心肌细胞能量代谢指标ATP、Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶水平比较 与假手术组比较,模型组大鼠心肌细胞ATP、Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶水平均降低(P<0.05)。与模型组比较,益气活血药组及益气活血药+氯喹组大鼠心肌细胞ATP、Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶水平均升高(P<0.05),氯喹组ATP、Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶水平与模型组比较差异均无统计学意义(P>0.05)。与益气活血药组比较,氯喹组及益气活血药+氯喹组大鼠心肌细胞ATP、Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶水平均降低(P<0.05)。见表3。

表3 各组大鼠心肌细胞能量代谢指标ATP、Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶水平比较

3 讨论

临床上针对心肌梗死最为重要且常见的治疗方法是以实现血管再通为目的,由此恢复心肌细胞的血液供应。近年来,随着动脉搭桥技术、溶栓疗法、经皮腔内冠状血管成形术、心脏外科体循环等医疗技术的不断发展及推广,心肌梗死患者在发病后已经可充分实现血液的再灌注[8]。但部分患者缺血之后的再灌注不能促使心肌功能恢复至正常范围,甚至可导致心肌细胞损伤的加重,这种现象被称为心肌缺血再灌注损伤[9]。目前对于心肌缺血再灌注损伤的发病机制尚未明确,一般认为与氧化应激反应、能量代谢障碍、细胞内钙超载等因素有关,是诱发并导致缺血再灌注损伤的重要病理机制[10]。ROS是机体有氧代谢过程中的一种产物,高水平的ROS会对细胞和基因结构造成损坏,而CAT是天然的抗氧化酶,对机体的氧化/抗氧化平衡起着至关重要的作用,T-AOC可反映机体内总体的抗氧化水平,其含量可决定机体的抗氧化能力[11]。研究表明,心肌细胞能量代谢障碍贯穿从心肌代偿性肥大到心力衰竭的全过程,心肌缺血再灌注损伤的始动环节也可能与能量代谢障碍有关。ATP作为心肌细胞直接供能物质,ATP含量的减少与心肌细胞凋亡密切相关,而线粒体作为释放能量的场所,心肌细胞中90%的ATP来源于线粒体,提高线粒体ATP及能量代谢ATP酶含量可有效减轻心肌细胞的损伤[12]。本实验结果显示,与假手术组比较,模型组大鼠造模后心功能指标LVEDd、LVESd均升高(P<0.05),LVFS、LVEF均降低(P<0.05),心肌组织ROS水平升高(P<0.05),CAT、T-AOC水平均降低(P<0.05),心肌细胞ATP、Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶水平均降低(P<0.05)。提示模型组大鼠造模后心肌组织生理形态和线粒体结构均出现不同程度损害,心功能出现严重障碍,心肌抗氧化能力下降,并伴有心肌细胞能量代谢障碍的出现。

心肌梗死属中医学胸痹范畴,属本虚标实之证,以心气虚为本,气滞血瘀为标。中医学认为,心主血脉,统摄全身血液运行,负责机体组织、器官的营养供给。《素问·五脏生成》言:“诸血者,皆属于心。”气为血之帅,气行则血行,气滞则血瘀,心气充足,气血相辅相成,则可维持机体正常生理活动,若心气不足,推动无力,气血运行滞涩,痹阻心脉,不通则痛,发为胸痹。虽然西医采取相关治疗措施可以短时间内实现心肌缺血再灌注,但由于本虚尚在,欲速不达,故而会出现再灌注损伤。益气活血药方是在经典方剂当归补血汤基础上化裁而来,方中黄芪、人参健脾益气,生津养血;当归、川芎、三七补血活血,行气化瘀。前期研究已经表明,益气活血药对心脏有保护作用,具有减轻炎性反应损伤、促进心肌重构、调节细胞骨架结构稳定性、改善冠状动脉微循环障碍等多方面作用[13-16]。现代药理学研究表明,黄芪含有黄芪多糖、黄酮类、皂苷类、氨基酸等多种有效成分,可促进一氧化氮(NO)的生成,降低内皮素水平,清除氧自由基,对血管内皮产生较强的保护作用,还能调节血脂,改善血流动力学指标,抑制血栓形成等[17];人参具有抗血小板活化及抗氧化应激的作用,还可保护内皮细胞,避免不良心血管事件的发生[18];丹酚酸B作为丹参的一种有效成分,对内皮细胞氧化损伤具有保护作用[19];三七具有较强的抗血栓、抗炎、抗氧化及调节血管内皮细胞功能等作用[20];当归、川芎能够明显改善血瘀模型大鼠的血液流变学指标及凝血功能异常[21]。本研究结果显示,与模型组比较,益气活血药组及益气活血药+氯喹组大鼠心功能指标LVEDd、LVESd均降低(P<0.05),LVFS、LVEF均升高(P<0.05),心肌组织ROS水平均降低(P<0.05),CAT、T-AOC水平均升高(P<0.05),心肌细胞ATP、Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶水平均升高(P<0.05),且益气活血药组各指标的改善均优于益气活血药+氯喹组(P<0.05),而氯喹组各指标水平与模型组比较差异均无统计学意义(P>0.05)。提示经益气活血药方干预治疗后可有效促进心肌组织和线粒体结构修复,改善心肌功能,提高心肌抗氧化能力,改善心肌细胞能量代谢,而氯喹作为一种自噬抑制剂对心肌细胞损伤的修复、抗氧化能力的提升及能量代谢障碍的改善并没有明显治疗作用。

综上所述,益气活血药方对心肌缺血再灌注损伤具有保护作用,可明显促进心功能恢复,其作用机制可能与提高心肌抗氧化能力,改善线粒体功能和能量代谢有关。将来可进一步开展大样本、多指标、长时间的临床研究,以更好的对益气活血药方的临床治疗优势进行分析和探讨。