慢性阻塞性肺疾病急性加重痰热壅肺证尿液代谢组学研究※

刘 锐 刘付昌盛 卢梦月 田 智

(1.广西中医药大学附属瑞康医院呼吸内科,广西 南宁 530000;2.广西中医药大学2018级硕士研究生,广西 南宁 530000)

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructivepulmonary disease,COPD)是一种常见的以持续气流受限为特征的慢性呼吸系统疾病,其中COPD急性加重(AECOPD)是指患者出现超越日常状况的持续恶化,短期内咳嗽、咯痰、气短和/(或)喘息加重,痰量增多,呈脓性或黏脓性,可伴发热等炎症明显加重的表现,并需改变基础COPD常规用药。AECOPD属中医学“喘证”“肺胀”等范畴,认为其发病多是由于感受外邪、痰浊内蕴、情志失调等因素导致肺宣降功能失调所引起。中医诊疗过程讲究“理法方药,辨证论治”,其中“证”是对疾病过程中所处阶段病位、病因、病性及病势等所作的病理性概括[1]。目前,中医辨证均以症状、体征、舌象、脉象等为依据,但在辨证过程中往往会因个人经验丰浅不同而致使辨证结果不一致,这就导致了不同医生对同一患者的证候诊断难以重复,因此目前对于“证”的判断最大的问题就是太多主观指标,而缺乏全面、准确的客观指标来辅助诊断。先前有学者通过代谢组学技术探讨了AECOPD痰热壅肺证的血清代谢组学情况,都取得了很好的成果[2]。本研究通过运用最新代谢组学技术液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)对比AECOPD痰热壅肺证患者与健康人的尿液差异,寻找其可能的尿液代谢标志物,并分析其代谢通路,以为中医“证”的判断提供更加科学的依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2020年1月至2020年12月在广西中医药大学附属瑞康医院呼吸内科和老年病科住院的10例AECOPD痰热壅肺证患者为试验组,男5例,女5例,年龄(55.40±4.71)岁,第1秒用力呼气容积/用力肺活量(FEV1/FVC)(68±0.77)%,FEV1占预计值的百分比(FEV1%pred)(69±1.18)%。另选取10例同期体检健康者为空白组,男5例,女5例,年龄(53.40±2.36)岁。设置试验组为A组,10名患者标记为a1、a2、a3……a10,设置空白组为Z组,10名健康者标记为z1、z2、z3……z10。

1.2 病例选择

1.2.1 诊断标准

1.2.1.1 AECOPD 西医诊断参照《慢性阻塞性肺疾病急性加重(AECOPD)诊治中国专家共识(2014年修订版)》中AECOPD的诊断标准[3]。中医诊断参照《慢性阻塞性肺疾病中医证候诊断标准(2011版)》中AECOPD痰热壅肺证的辨证诊断标准[4]。

1.2.1.2 健康 参照《中医体质分类与判定(ZYYXH/T157-2009)》[5]标准进行中医体质辨识为平和质,且经临床医生判定为健康。

1.2.2 纳入标准 符合上述AECOPD的中、西医诊断及健康标准;年龄40～75岁,AECOPD病情分级为Ⅰ～Ⅱ级;入选前3个月内未参加其他药物干预的临床研究;自愿接受试验,并签署相关的知情同意书。

1.2.3 排除标准 诊断为慢性支气管炎,但未达到COPD标准者;COPD稳定期患者;合并有支气管扩张、弥漫性泛细支气管炎、肺栓塞、肺性脑病及其他慢性肺部疾病者;合并有结核、真菌感染或其他肺部疾病引起的咳嗽、咯痰、喘息者;合并有循环系统、神经系统、消化系统、造血系统等严重疾病者;合并有精神病、智力低下、认知功能缺陷、癫痫等疾病者。

1.3 研究方法

1.3.1 主要仪器与试剂 数据采集仪器系统主要包括串联质谱(美国SCIEX公司)和超高效液相色谱(美国SCIEX公司)。试剂包括甲醇、乙腈(级别:色谱纯,德国Merck公司)、标准品(级别:色谱纯,美国Sigma-Aldrich公司)。

1.3.2 样品采集与保存 2组均需清淡饮食而且空腹8 h后,于次日早上留取晨尿10 mL,然后将标本放在4 ℃环境下静置10 min,再抽取1 ml尿液进行离心,10 000转/min,温度4 ℃,离心5 min,离心后吸取上层尿液800 μL,并将样本储存于-80 ℃冰箱,备用。

1.3.3 液相条件与质谱条件

1.3.3.1 液相条件 ①色谱柱:Waters ACQUITY UPLC HSS T3 C181.8 μm,2.1 mm×100 mm。②流动相:A相为超纯水(0.1%的甲酸),B相为乙腈(0.1%的甲酸)。③洗脱梯度:水/乙腈0 min为(95∶5V/V),11.0min为(10∶90V/V),12.0 min为(10∶90V/V),12.1 min为(95∶5V/V),14.0 min为(95:5V/V)。④流速0.4 mL/min,柱温40 ℃,进样量2 μL。

1.3.3.2 质谱条件 电喷雾离子源(ESI)温度500 ℃,质谱电压5500 V(positive)-4500 V(negative),离子源气体Ⅰ(GSⅠ)55psi,气体Ⅱ(GSⅡ)60psi,气帘气(CUR)25psi,碰撞诱导电离(CAD)参数设置为高。在三重四极杆(Qtrap)中,每个离子对是根据优化的去簇电压(DP)和碰撞能量(CE)进行扫描检测。

1.4 代谢物定性与定量 基于自建靶向标品数据库(MWDB),根据检测标本的保留时间(RT)、子母离子对信息及二级谱数据进行定性分析,代谢物的定量是基于三重四极杆质谱多反应监测模式(MRM)的分析原理完成。

1.5 数据评估 经上述定性定量分析的数据采用正成分和聚类分析进行数据评估,采用质控样本(QC)以确保仪器分析的数据具有重复性和可靠性。

1.6 数据结果分析 经对数据进行主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)处理后筛选,筛选原则:①当差异性代谢产物属于上调时,则按照差异倍数(FC)≥2筛选,而当差异性代谢产物属于下调时,按照FC≤0.5筛选差异性代谢产物;②在上述的基础上,同时选取投影的可变重要性(VIP)≥1的差异代谢物。上述筛选的代谢产物再通过京都基因与基因组百科全书(KEGG)数据库和人类代谢组数据库(HMDB)进行通路富集分析并筛选重要的差异代谢物。

2 结果

2.1 2组PCA分析 PCA分析可以了解2组样本之间的总体代谢差异和组内样本之间的变异度大小,图中颜色范围表示本组的95%可信区间。结果显示2组各样本可以得到很好区分。见图1。

图1 2组PCA分析图

2.2 2组OPLS-DA分析 颜色范围表示每组的95%可信区间。结果显示2组的可信区间可以得到很好的区分。见图2。

2.3 2组差异代谢物筛选结果 差异代谢物经筛选后,共筛选出143个差异代谢物,其中上调的代谢物有59个,下调的代谢物有84个,上升的是咖啡因、可可碱、1,7-二甲基尿酸等,下降的是肉毒碱、泛酸、L-半胱氨酸等,差异代谢物在2组间的差异显著。见表1、图3。

表3 2组部分差异代谢物筛选结果

注:图中的每个点表示1种代谢物,横坐标表示某代谢物在两样品中定量FC的对数值,纵坐标表示VIP值,绿点代表下调(Down)的差异代谢物,红点代表上调(Up)的差异代谢物,黑色代表检测到但差异不显著(Insignificant)的代谢物。

2.4 2组差异代谢物通路富集分析及筛选结果 2组差异代谢物通过KEGG数据库和HMDB数据库进行通路富集分析并筛选显示,主要涉及半胱氨酸和蛋氨酸代谢(Cysteine and methionine metabolism)、色氨酸代谢(Tryptophan metabolism)、缬氨酸,亮氨酸和异亮氨酸的降解(Valine,leucine and isoleucine degradatior)、泛酸酯和辅酶A的生物合成(Pantothenate and CoA biosynthesis)、咖啡因代谢(Caffeine metabolism)等通路,再经过筛选得出8个重要差异代谢物,即半胱氨酸、甲酰蛋氨酸、色氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、泛酸、咖啡因及可可碱。见图4、5。

注:图中点越大或者越红表示富集到相应通路上的差异代谢物个数多

注:图中点越大或者越红表示富集到相应通路上的差异显著代谢物个数多

3 讨论

“辨证论治”是中医诊疗学中精髓所在,但临床实际“辨证”中最大的问题就是主观性太强,而缺乏对应的全面、准确的客观指标来辅助诊断。代谢组学是继基因组学和蛋白质组学之后新近发展起来的一门学科,是系统生物学的重要组成部分。王喜军等[6]认为,中医方证代谢组学的理论及方法有助于实现建立中国式精准医学模式,有助于进一步提升中医药研发的原始创新能力。相关研究表明,AECOPD患者的代谢组学主要是氨基酸、维生素、糖类、脂肪等人体能量物质的含量发生变化,其相关代谢通路受到扰动[7-8]。本研究结果也显示,半胱氨酸、甲酰蛋氨酸、色氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、泛酸、咖啡因及可可碱可能是AECOPD痰热壅肺证尿液代谢标志物,涉及半胱氨酸和蛋氨酸代谢、色氨酸代谢、缬氨酸,亮氨酸和异亮氨酸的降解、泛酸酯和辅酶A的生物合成、咖啡因代谢等通路。

半胱氨酸是人体的条件必需氨基酸和生糖氨基酸,具有抗氧化、抗炎等多种作用,不仅能够明显抑制炎性反应中活性氧对核因子κB(NF-κB)通路的活化,而且减少了炎症因子的转录和表达[9],同时半胱氨酸的衍生物乙酰半胱氨酸、半胱氨酸甲酯等为呼吸道黏液溶解剂,并具有促进受损支气管黏膜修复的作用。半胱氨酸可由体内的甲酰蛋氨酸转化而来,半胱氨酸和甲酰蛋氨酸均下降可促进炎性反应的发生,加快炎症因子的转录和表达[10]。

色氨酸是5-羟色胺的前体,是人体中重要的神经递质,相关研究表明色氨酸参与了AECOPD的发生发展,机制可能通过参与抗氧化应激和炎性反应有关[11]。色氨酸代谢途径主要分为合成组织蛋白质和分解代谢,经氧化后可转变为烟酸。烟酸属于维生素B族[12],又称尼克酸、维生素B3,具有防止细菌侵袭及炎性反应的作用,烟酸的减少可导致人体防止细菌侵袭及炎性反应的作用降低,而且影响了机体氧化还原反应,烟酸下降还可加重色氨酸的下降,导致AECOPD痰热壅肺证患者氧化应激与抗氧化应激失衡,炎性反应加重。

异亮氨酸、亮氨酸为人体必需氨基酸,主要存在于肌肉和肾、脑等重要器官中。异亮氨酸、亮氨酸及缬氨酸都是支链氨基酸,通过氨基酸的氧化作用为机体供能,能够更快地分解转化为葡萄糖,可为组织长时间持续运动提供能量,其下降说明机体摄入减少或机体消耗能量增加,引起呼吸肌功能下降,导致肺的呼吸肌疲劳和呼吸衰竭,进而诱发COPD急性加重的发作[13]。

泛酸又叫维生素B5,有多种生物功能,如提供能量、提供活性物质、激活免疫功能等[14]。泛酸在人体内可转变成辅酶A,参与脂肪酸代谢反应。辅酶A在新陈代谢中主要发挥酰基载体的功能,参与蛋白质和能量代谢等多种生物活动,还可以通过修饰蛋白质来影响蛋白质的定位、稳定性及活性,辅酶A为生物体提供了90%的能量。泛酸也可以通过增加谷胱甘肽的生物合成,从而减缓细胞凋亡和损伤,可以对损伤的细胞具有很好的保护作用。泛酸的下降影响了泛酸酯和辅酶A的生物合成代谢通路,导致人体能量下降,加快细胞的损伤,从而引起COPD的急性发作。

可可碱能抑制嗜中性粒细胞黏附和激活,抑制促炎因子的产生和释放,促进抑炎因子的生成,对肺功能损伤恢复有一定的保护作用[15]。可可碱甲基化后即为咖啡因,咖啡因在肝脏中被分解产生3种代谢产物,分别是副黄嘌呤、可可碱及茶碱,其中茶碱具有舒张呼吸肌作用。此外咖啡因不仅有抗氧化、舒张血管、松弛平滑肌等作用,还具有缓解COPD患者呼吸肌疲劳的作用[16]。AECOPD患者体内的咖啡因和可可碱均上升,可能是机体为了对抗自身炎症和缓解呼吸肌疲劳代偿性升高导致的。

COPD是一种破坏性的肺部疾病,是以不完全可逆的气流受限为特征的疾病,气流受限通常呈进行性发展并与肺对有害颗粒或气体的异常炎症反应有关[17-18]。COPD是一种可以预防和治疗的慢性气道炎症性疾病,COPD虽然是气道的疾病,但对全身的系统影响也不容忽视[19-20]。综上所述,AECOPD痰热壅肺证患者较健康人相比可见氨基酸、维生素等人体能量物质含量的变化,其中半胱氨酸和蛋氨酸代谢、色氨酸代谢及咖啡因代谢通路异常可引起患者氧化应激与抗氧化应激失衡,炎性反应加重,导致机体抵抗力降低,如感染细菌、病毒等,从而引起患者气喘、咳嗽、咯痰等症状;缬氨酸,亮氨酸和异亮氨酸的降解、泛酸酯和辅酶A的生物合成代谢通路异常,反映了AECOPD痰热壅肺证患者患病日久,正气损伤,卫气不足,以致体内蛋白质等能量物质相应的损耗增多,能量代谢异常,从而引起患者呼吸肌疲劳,导致呼吸困难、乏力等症状。总之,分析研究差异代谢物和异常代谢通路为探索AECOPD痰热壅肺证的本质提供了可能,可为疾病早期中医诊断、预防及治疗提供依据,而且随着代谢组学技术的发展,可以更好地从代谢组学层面研究探讨中医,搭建中医与现代医学的桥梁,促进中医的发展,为人类的健康更好地服务。