肾气丸对糖尿病ZDF大鼠肾脏的保护作用

吴 丹,冯 靖,车宇娥,张晓风,刘雨梦,刘嘉鹏,王 谦,李姝玉

(北京中医药大学 中医学院病理学教研室,北京 100029)

据2019年的统计,在全世界范围内20～79岁的成年人群中,糖尿病(diabetes mellitus,DM)的发病人数高达4.63亿[1]。值得注意的是,DM最常见的微血管并发症之一是糖尿病肾脏疾病(diabetic kidney disease,DKD),DKD同样也是糖尿病患者出现残疾和死亡的一个主要原因[2-3]。基底膜厚度增加,肾小球出现硬化,肾小球系膜区增宽,足细胞减少及足突融合消失等均为DKD的肾脏病理变化;DKD患者的临床症状可表现为肾功能不全以及白蛋白尿增加[4-5]。DKD早期足细胞结构和功能的损伤,是引起患者蛋白尿及肾功能不全的病理结构基础[6]。中医治疗糖尿病肾病的研究较多且疗效显著[7-9]。

肾气丸来源于医圣张仲景的名方,其处方共由八位药组成,包括山药、干地黄、泽泻、山茱萸、牡丹皮、茯苓、炮附子及桂枝,各味药在临床中被广泛应用于治疗DKD,疗效显著[10]。然而,其治疗DKD的作用机制尚不清楚。本课题组以往的研究中已发现,肾气丸能够缓解2型糖尿病小鼠肾组织结构及功能损伤,本实验以Zucker糖尿病肥胖(zucker diabetes fatty,ZDF)大鼠作为DKD模型,在药效学及病理学评价基础上,观察肾气丸对肾功能、肾脏组织结构及足细胞损伤的影响,为中医经典方剂在糖尿病与DKD 的应用上提供更加丰富的现代解读。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 实验动物为SPF级雄性ZDF(fa/+)和ZDF(fa/fa)大鼠。ZDF(fa/fa)大鼠是研究2型糖尿病的动物模型,由Zucker大鼠近交繁殖得到,为瘦素受体基因(Fa基因)突变产生的隐性基因,经特殊饲料诱导后,可自发出现肥胖、胰岛素抵抗、高血脂等代谢异常综合征。ZDF(fa/+)是与ZDF(fa/fa)基因同源性的大鼠,可正常表达瘦素受体,调节摄食和机体能量平衡,无代谢紊乱症状,常用作ZDF(fa/fa)大鼠的对照组模型动物。选取14只12周龄ZDF(fa/+)大鼠作为对照组,体重350 g左右。选取40只12周龄ZDF(fa/fa)大鼠(已喂养5C08优质啮齿类饲料诱导4周,建立2型糖尿病模型)作为模型组及肾气丸组,体重400 g左右,测定血糖,并且选取随机血糖 ≥ 16.7 mmol/L的大鼠为模型成功大鼠;按随机数字表法随机分为模型组及肾气丸组,每组20只;3组大鼠12周龄不取材,测定血糖,16及20周龄取材;12、16、20周龄对照组大鼠各7只,12、16、20周龄模型组大鼠各10只,12、16、20周龄肾气丸组大鼠各10只。大鼠购买自北京维通利华实验动物技术有限公司,许可证号:SCXK(京)2016-0011,北京市实验动物质量合格证号:No.110011201105943334。于中日友好医院临床研究所动物实验平台饲养,选择屏障内独立通风系统的饲养环境,室温控制在23 ～25 ℃,相对湿度保持在50%～60%,大鼠可以自由进食及饮水,每日光照时间控制在12 h以内。5C08优质啮齿类饲料进口登记证号:(2017)外饲准字354号,普通饲料由中日友好医院临床研究所动物实验平台提供,许可证号:SCXK(京)2019-0008。 本实验通过了北京中医药大学学术委员会实验动物伦理分委会的审核及批准(伦理编号BUCM-4-2021102801-4034)。

1.1.2 实验药物 肾气丸购买自北京同仁堂药店;生理盐水购买自山东华鲁制药有限公司,规格500 mL,批准文号:国药准字H37022749,产品批号:H17100912。根据2015年第一版《伤寒论方药剂量与配伍比例研究》中汉制度量衡古今比例,对《金匮要略》中肾气丸的原方剂量进行换算,得出实验所需组方剂量为:熟地黄24 g、山药12 g、山茱萸12 g、泽泻9 g、茯苓9 g、牡丹皮9 g、桂枝3 g、炮附子3 g。同时根据1997年第一版《实验动物的疾病模型》提供数据换算得出每只大鼠每日给药量为8.12 g/kg,给药浓度为0.812 g/mL。制备肾气丸水煎液,药物用蒸馏水浸泡2 h后,炮附子先煎30 min,剩余药物一起煎煮1～1.5 h,待药液降至室温后浓缩,无菌纱布进行过滤,滤液分装入离心管-20 ℃冻存备用。药物贮存时间不超过1周,用前从冰箱中取出药液静置,待药液升至室温时再给药。生理盐水4 ℃冷藏保存,随用随取。

1.1.3 试剂 甘油三酯(TG)、肌酐(CRE)、总胆固醇(CHOL)、尿酸(UA)及尿素氮(BUN)测试试剂盒均购自于南京建成生物工程研究所,批号分别为A-110-1-1,C011-2-1,A111-1-1,C012-2-1,C013-2-1;伊红及苏木素染色液均购自于北京中杉金桥生物技术有限公司,批号分别为ZLI-9613及ZLI-9610;改良Masson三色染色液及糖原PAS染色试剂盒购自于北京索莱宝科技有限公司,批号分别为G1345,G1281;六胺银染色液购自于北京雷根生物技术有限公司,批号DG0090。

1.1.4 实验仪器 RM2165切片机,光学显微镜(德国Leica公司);台式冷冻离心机(美国Beckman公司);移液枪(0.1～1 000 μL,德国Eppendorf公司);Synergy Ⅱ型酶标仪(美国Bio-Tek公司);ME303E千分之一电子天平(上海梅特勒-托利多国际贸易有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及给药 实验组别分为对照组、模型组与肾气丸组3组。对照组选用12周龄ZDF(fa/+)大鼠;模型组与肾气丸组选用12周龄雄性ZDF(fa/fa)大鼠。每日给予对照组及模型组大鼠灌服生理盐水(10 mL/kg)处理;肾气丸组每日灌服肾气丸水煎液(8.12 g/kg)。

1.2.2 指标检测

1.2.2.1 大鼠一般状况的观察记录 每天观察并记录大鼠饮食饮水量、尿量、毛光泽度、活动情况以及给药前后的状态等。

1.2.2.2 大鼠体重记录及空腹血糖检测 定期给大鼠称重,检测大鼠空腹血糖。血糖检测用尾尖取血法,即先将大鼠禁食不禁水8 h后,用罗氏血糖仪及配套试纸检测。

1.2.2.3 大鼠尿微量白蛋白检测 于16周龄和20周龄收集大鼠24 h尿液,将尿液3 500 r/min离心10 min,取上清,放于-20 ℃备用;Elisa法检测大鼠尿微量白蛋白。

1.2.2.4 透射电镜观察 对16周龄和20周龄大鼠分批取材,取材之前大鼠禁食8 h处理,不禁水,之后进行胸腹部备皮,分离腹主动脉取血,剥离两侧肾脏,取约25 mm3大小的肾组织,4% 组织固定液中固定,做石蜡切片;切下约1 mm3左右大小的肾组织若干个,立刻浸入2.5%的戊二醛固定液中进行固定,4 ℃冷藏,做透射电镜观察。

1.2.2.5 血液生化指标检测 对16周龄和20周龄大鼠进行主动脉取血后,应用血清生化试剂盒检测血清中CHOL、TG、CREA、UA和BUN的含量。

1.2.2.6 病理学染色观察肾组织病理结构改变 取16周龄和20周龄大鼠肾组织,固定的组织进行洗涤、脱水,之后经由透明、浸蜡、包埋以及切片。切片经由脱蜡、水化后,分别进行HE、Masson、PAS和六胺银染色,之后进行脱水、透明及封片,光学显微镜下观察切片,并进行图像采集及分析。

1.2.2.7 荧光染色观察nephrin的表达 将石蜡切片水化后,经由抗原修复、孵育一抗、孵育二抗、DAPI染色、封片后,经过激光共聚焦显微镜观察采集图片后分析。

2 结果

2.1 糖尿病ZDF大鼠一般状态观察 在饲养过程中,对照组ZDF(fa/+)大鼠毛发有光泽、活动灵敏、精神状态良好;模型组ZDF(fa/fa)大鼠出现肥胖、体毛缺乏光泽、尿量明显增多和活动迟缓等表现,其中肾气丸组相较模型组症状有所改善。

2.2 肾气丸对糖尿病ZDF大鼠体重的影响 与对照组比较,16周龄和20周龄模型组大鼠体重增长率呈现明显下降的趋势(P<0.05),肾气丸组大鼠的体重增长率相较模型组明显升高,且差异具有统计学意义(P<0.05,表1)。

表1 肾气丸对ZDF大鼠体重增长率的影响

2.3 肾气丸对糖尿病ZDF大鼠空腹血糖的影响 12周龄、16周龄和20周龄模型组及肾气丸组大鼠空腹血糖均较对照组明显升高,且差异具有明显统计学意义(P<0.05);16周龄与20周龄肾气丸组大鼠空腹血糖相较模型组明显降低,差异具有统计学意义(P<0.05,表2)。

表2 肾气丸对ZDF大鼠空腹血糖的影响

2.4 肾气丸对糖尿病ZDF大鼠血脂的影响 总胆固醇结果显示,16周龄和20周龄模型组和肾气丸组均较对照组高(P<0.05),肾气丸组16周龄较模型组低(P<0.05),而20周龄组无显著差异。甘油三酯结果显示,16周龄和20周龄模型组均高于对照组(P<0.05),肾气丸组均较模型组显著降低,差异具有统计学意义(P<0.05,表3)。

表3 肾气丸对ZDF大鼠血脂的影响

2.5 肾气丸对糖尿病ZDF大鼠肾功能血清指标的影响 肌酐和尿酸结果显示,16周龄和20周龄模型组和肾气丸组均高于对照组(P<0.05),肾气丸组大鼠均较模型组显著降低,差异具有统计学意义(P<0.05);尿素氮结果显示,16周龄3组之间差异无统计学意义(P>0.05),20周龄模型组大鼠较对照组显著升高,肾气丸组大鼠较模型组明显降低,差异具有统计学意义(P<0.05,表4)。

表4 肾气丸对ZDF大鼠肾功能血清指标的影响

2.6 肾气丸对糖尿病ZDF大鼠尿微量白蛋白水平的影响 动物饲养过程中发现模型组大鼠饮水量和尿量较对照组显著增多,垫料潮湿、异味较大,肾气丸组上述情况有所改善。尿微量白蛋白数据显示,16周龄和20周龄模型组均较对照组高,肾气丸组相较模型组显著下降,差异具有统计学意义(P<0.05,表5)。

表5 肾气丸对ZDF大鼠尿微量白蛋白水平的影响

2.7 肾气丸对糖尿病ZDF大鼠肾组织病理改变的影响 糖尿病ZDF大鼠肾组织HE染色后,可见对照组大鼠肾小球、肾小管结构正常;16周龄和20周龄模型组大鼠肾小球毛细血管扩张充血,肾小管上皮细胞胞浆疏松,有空泡样改变,系膜区宽度增加,病变随着周龄增加而加重;肾气丸组大鼠上述病变相较模型组有所减轻,见图1。

A:对照组;B:模型组;C:肾气丸组;数字1和2分别对应16周龄和20周龄大鼠;×400。图1 各组大鼠肾组织HE染色

大鼠肾组织Masson染色结果显示,对照组大鼠肾小球、肾小管结构完整清楚,无间质纤维化;16周龄和20周龄模型组大鼠肾组织内出现肾小球纤维化,肾小管萎缩,肾间质胶原组织增多,病变随着周龄增加而加重;肾气丸组相较模型组病变有所减轻,见图2。

A:对照组;B:模型组;C:肾气丸组;数字1和2分别对应16周龄和20周龄大鼠;×400。图2 各组大鼠肾组织Masson染色

大鼠肾组织PAS染色结果显示,16周龄和20周龄模型组大鼠系膜区增宽,出现肾小球硬化,部分肾小管上皮细胞内有糖原沉积;肾气丸组大鼠相较模型组大鼠上述病变有所减轻,见图3。

A:对照组;B:模型组;C:肾气丸组;数字1和2分别对应16周龄和20周龄大鼠;×400。图3 各组大鼠肾组织PAS染色

大鼠肾组织六胺银染色结果显示,对照组大鼠肾小球、肾小管结构正常;16周龄和20周龄模型组大鼠肾小球基底膜出现增厚,系膜区扩张,病变随着周龄增加而加重;肾气丸组大鼠相较模型组大鼠上述病变有所减轻。以16周龄为例,见图4。

A:对照组;B:模型组;C:肾气丸组;×400。图4 各组大鼠肾组织六胺银染色

2.8 肾气丸对糖尿病ZDF大鼠肾组织超微结构的影响 透射电镜结果显示,对照组大鼠基膜结构完整清晰,足细胞足突完整、排列整齐有序,足细胞线粒体结构正常;16周龄和20周龄模型组大鼠肾小球基膜增厚,足突出现融合,足细胞线粒体肿胀或溶解;肾气丸组大鼠相较模型组病变有所改善。以16周龄为例,见图5。

A:对照组;B:模型组;C:肾气丸组;数字1和2分别对应展示基膜和足细胞足突系膜区;A1、B1、C1、A2×20 000,B2、C2×8 000。图5 各组大鼠肾组织电镜超微结构变化

2.9 肾气丸对糖尿病ZDF大鼠肾组织足细胞标志物nephrin表达水平的影响 免疫荧光结果显示,对照组大鼠肾组织中nephrin表达荧光较强,模型组nephrin表达荧光强度明显弱于对照组,肾气丸组nephrin表达荧光强度相较模型组增强。以16周龄为例,见图6。

A:对照组;B:模型组;C:肾气丸组;×400。图6 各组大鼠肾组织nephrin免疫荧光染色

3 讨论

DKD是慢性消渴并发症,在中医学中归属于“消肾”“消渴”“水肿”“尿浊”“虚劳”和“关格”的范畴[10]。肾虚为其根本[11]。气阴两虚可以导致肾气固摄失败,引起封藏失职,继而精关不固,而后精微下泄,从而导致DKD患者蛋白尿的形成[12]。DKD的治疗以补肾摄精、滋阴温阳及化瘀排浊为主[13]。

肾气丸是滋肾阴补肾阳的经典名方[10]。临床研究发现,肾气丸加减治疗DKD疗效显著,可改善DKD病人多项糖代谢、血脂及肾功能指标,有效缓解DKD患者的临床症状[14-16];在常规西药治疗基础上,肾气丸和当归补血汤联合使用也可提高糖尿病治疗的有效性和安全性[17]。此外,动物实验研究发现,肾气丸能降低DKD模型大鼠空腹血糖[18];改善腺嘌呤诱导的肾阳虚大鼠的肾功能指标,减轻大鼠肾间质纤维程度[19]。DKD患者血糖及血脂的控制至关重要;患者血脂升高可诱导心脑血管并发症的发生。本研究证实,肾气丸可以减轻糖尿病ZDF大鼠的空腹血糖水平,降低血清总胆固醇及甘油三酯水平,提示肾气丸具有改善糖尿病大鼠糖脂代谢紊乱的作用。

血肌酐、尿素氮及尿微量白蛋白等是反映病人肾小球滤过及肾小管重吸收等肾功能的常用指标。既往研究也发现,应用金匮肾气汤可使db/db糖尿病小鼠的尿白蛋白水平降低[20]。本研究发现,肾气丸可以降低糖尿病大鼠血清肌酐、尿酸、尿素氮以及尿微量白蛋白水平,表明肾气丸可以改善肾小球滤过功能,减少DKD蛋白尿。

DKD的基本病理改变为肾小球毛细血管基底膜增厚和系膜细胞增生,以及上述两种病变导致的肾小球硬化。本课题组前期的实验中检测到糖尿病小鼠肾组织肾小球系膜基质增多、基底膜增厚以及足细胞损伤等病变[21]。本实验进一步证实在DKD大鼠出现肾小球毛细血管扩张充血、肾小球纤维化、肾小球硬化、系膜区增宽、肾小管上皮细胞内糖原沉积等病变。在超微结构变化中,观察到DKD大鼠出现肾小球基膜增厚、基质增多等结构变化。而肾气丸可以改善上述病理过程,提示肾气丸可能通过延缓肾小球硬化的发生治疗DKD。

既往研究表明,肾气丸治疗DKD的作用机制与肾纤维化、微炎症状态、氧化应激等相关[22]。近期研究表明,肾气丸治疗DKD的作用机制还可能与其对足细胞结构具有保护作用有关。已证实,高糖刺激导致足细胞出现足突融合、掉落或去分化等改变,从而使得肾小球滤过膜结构出现损伤促进了蛋白尿的形成。刘春燕等[20]研究发现,肾气丸可保护db/db小鼠肾脏足细胞,减少足细胞凋亡,改善足突融合;肾气丸也可促进足细胞自噬,延缓DKD的进展[23]。本研究发现肾气丸可减轻DKD大鼠足细胞足突融合,缓解DKD大鼠足细胞出现线粒体肿胀溶解等超微结构损伤,从而减轻DKD蛋白尿症状。Nephrin作为足细胞标志物,是肾小球滤过屏障的主要组成部分,其基因表达的改变和肾病密切相关。有研究表明,nephrin表达的变化与糖尿病肾病中肾功能下降、蛋白尿出现以及肾小球的硬化是密切相关的[24]。在肾病患者中,可以检测到nephrin的表达下调,且其下降程度和蛋白尿的进展呈正相关[25]。本研究进一步表明nephrin在DKD大鼠肾组织中表达减少,肾气丸治疗则增加nephrin的表达。以上结果均提示肾气丸可能经由改善足细胞结构及功能治疗DKD。

综上所述,肾气丸填精益髓、培肾益气,可能通过改善足细胞结构和功能达到“补肾虚”的目的,从而治疗DKD。本研究是整体实验,还需后续的离体实验进行深入探讨,以进一步明确肾气丸改善糖尿病肾脏疾病肾损害及保护肾功能具体的作用机制。