实时荧光定量PCR技术检测妊娠晚期GBS感染的临床价值分析

钱云芳，徐敬轩，周文俊

1.江苏省丹阳市妇幼保健院检验科，江苏丹阳 212300；2.江苏省丹阳市人民医院检验科，江苏丹阳 212300

B族链球菌（group B streptococcal, GBS）属于寄生在生殖系统、下消化系统的常见致病菌，正常情况下感染风险较低，但妊娠晚期孕妇因激素分泌状态异常，可导致局部微生态环境产生变化，进而诱发孕晚期GBS感染[1-2]。GBS感染可造成早产、胎膜早破、宫内感染、新生儿感染等多种不良妊娠结局，对产妇以及新生儿的健康均存在一定不利影响[3-4]。传统检测GBS感染多予微生物培养的方式检查，但准确率不理想，检验时间较长，随着检验技术的发展，实时荧光定量聚合酶链式反应（poly⁃merase chain reaction, PCR）技术在妊娠晚期GBS感染的诊断中也有了较多应用[5-6]。为验证该检测技术的价值，本文选取2021年1—12月江苏省丹阳市妇幼保健院接收的180例妊娠晚期孕妇为研究对象，以基因测序法为金标准，分析了实时荧光定量PCR技术的诊断效能以及不良妊娠结局，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择本院接收的180例妊娠晚期孕妇为研究对象。年龄20~38岁，平均（27.95±2.16）岁；孕周32~38周，平均（35.40±1.07）周；初产妇114例，经产妇66例；基因测序检测结果证实，GBS感染阳性14例，阴性166例。本研究已申报医学伦理委员会批准。

1.2 纳入与排除标准

纳入标准：孕妇均处于孕晚期；均为单胎；近期未予抗生素治疗；未使用洗液、栓剂等；无妊娠期特殊疾病；孕妇及家属知情同意。

排除标准：采集标本质量差者；合并滴虫性阴道炎者；黏液性宫颈炎者；已明确不良妊娠者；不同意本研究者。

1.3 方法

所有受试者均常规开展实时荧光定量PCR检测。使用B族链球菌核酸检测试剂盒（荧光PCR法）[泰普生物科学（中国）有限公司，国械注准20153400272]。先清洁外阴分泌物，使用无菌窥阴器暴露患者阴道，而后使用无菌拭子置入阴道下1/3位置，旋转1周，采集阴道分泌物，保存在无菌套管中待检。另将无菌拭子置入肛门括约肌上2~3 cm位置旋转，采集直肠分泌物，装入无菌套管中。对所有检测标本先使用1 mL无菌氯化钠注射液混合震荡10 min，挤干拭子，而后移放标本悬液。13 000 r/min进行离心，时间10 min，取出上层清液，再以1 mL氯化钠注射液与沉淀物混合，继续离心10 min，采集沉淀物，加入DNA提取液。混匀后，放在99~100℃环境中加热，加热时间10 min，再离心10 min。取PCR反应液35 μl至反应管，并加入样本的上层清液5 μl，进行PCR扩增，尿嘧啶N糖基化酶（uracil N gycosylase, UNG）反应。50℃2 min；预变性，95℃ 5 min；PCR，95℃ 15 s，45个循环。60℃时，检测FAM、HEX通道荧光信号，选择反应体系40 μl。采用PCR仪分析软件获得Ct值，如≤23，且对数增长曲线良好，提示为阳性。基因测序检测时，根据医学检验中心比对编码CAMP蛋白序列以及标本中的基因序列分析结果判定，如都存在GBS特有基因序列，则为阳性。

1.4 观察指标

①以基因测序检测结果为金标准，分析实时荧光定量PCR技术的诊断效能，包括该技术诊断孕晚期GBS感染的准确率、灵敏度、特异度，并分析该技术与金标准的一致性。②根据金标准结果分组，比较阳性组与阴性组产妇不良结局发生率，包括早产、胎膜早破、宫内感染、胎儿窘迫。③比较阳性组与阴性组新生儿不良事件发生率，包括新生儿窒息、新生儿感染、低体重儿、新生儿肺炎。

1.5 统计方法

采用SPSS 21.0统计学软件处理数据，计数资料采用[n(%)]表示，进行χ2检验，一致性予Kappa检验，Kappa>0.75表示一致性较好。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 实时荧光定量PCR技术诊断孕晚期GBS感染的效能分析

实时荧光定量PCR技术检查诊断孕晚期GBS感染的准确率为99.44%（179/180）、灵敏度为92.86%（13/14）、特异度为100.00%（166/166），与金标准比较一致性较好（Kappa=0.96）。见表1。

表1 实时荧光定量PCR技术诊断孕晚期GBS感染的效能分析

2.2 两组产妇不良妊娠结局发生率比较

阳性组早产、胎膜早破、宫内感染、胎儿窘迫发生率均高于阴性组，差异有统计学意义（P<0.05）。见表2。

表2 两组产妇不良妊娠结局发生率比较[n(%)]

2.3 两组新生儿不良事件发生率比较

两组新生儿窒息、新生儿肺炎发生率比较，差异无统计学意义（P>0.05）；阳性组新生儿感染、低体重儿发生率均高于阴性组，差异有统计学意义（P<0.05）。见表3。

表3 两组新生儿不良事件发生率比较[n(%)]

3 讨论

GBS属于革兰阳性兼性厌氧菌，妊娠期女性因孕激素、雌激素水平异常，阴道内环境改变，糖原水平上升等因素影响，可导致阴道菌群失调，故而GBS感染的风险很高[7-8]。GBS感染可逆行扩散至胎膜，在炎症细胞作用下，导致胎膜蛋白分解，增加胎膜早破的风险，且可通过母婴垂直传播，增加阴道、子宫、新生儿感染等风险[9-10]。对此有必要进行GBS感染的早期诊断与治疗，以改善母婴结局。而在GBS感染的诊断中，传统多予细菌培养法进行诊断，但存在明显缺点，可重复性差，阳性检出率低，耗时长，敏感性不高，容易受到操作因素的影响，故有必要探讨更为可靠的诊断方案[11-12]。而采用实时荧光定量PCR技术进行检查时，其能够对不同种属GBS的特异性核算序列进行引物设计，并使用荧光探针标记，配合使用PCR仪，可在2~3 h内获得检测结果，检查准确率、灵敏度均较高，检测周期短，操作简单可靠[13-15]。本研究中，实时荧光定量PCR技术检查诊断孕晚期GBS感染的准确率为99.44%、灵敏度为92.86%、特异度为100.00%，与金标准比较一致性较好（Kappa=0.96），本研究结果证实PCR技术检测对GBS感染的诊断效能高。江平[16]研究中，实施荧光PCR筛查对诊断GBS感染的准确度、灵敏度、特异度分别为99.55%、97.62%、99.68%，均处于较高水平，与本研究结果具有一致性。而在孕妇情况上，阳性组早产、胎膜早破、宫内感染、胎儿窘迫发生率分别为14.29%、14.29%、21.43%、21.43%，均高于阴性组（P<0.05），则说明阳性群体不良妊娠结局的风险更高。马倩[17]研究中，阳性组早产、胎膜早破、胎儿窘迫率分别为28.74%、26.98%、19.94%，均较阴性组高（P<0.05），与本研究结果一致。而在新生儿情况上，阳性组新生儿感染、低体重儿发生率分别为14.29%、21.43%，均高于阴性组（P<0.05），则提示感染GBS可导致新生儿不良事件风险的增加。萧君明等[18]研究中，GBS阳性组不良结局发生率高于阴性组（12.85% vs 42.86%）（P<0.05），也证实GBS感染可增加新生儿不良事件的发生风险。

综上所述，对妊娠晚期孕妇予实时荧光定量PCR技术检测能有效检出GBS感染，诊断效能较高，可为临床预测孕妇与新生儿结局的工作开展提供依据。