长江典型城区河段在多因素影响下的细菌群落稳定性研究

周鹤林 黎琪 寇德会

摘要：为研究在人类活动和水流运动影响下的长江微生物群落结构稳定性，选取长江厦嘉睦江在重庆城区的河段为研究对象，采用16S rRNA高通量测序QPCR技术进行分析。结果表明：研究河段的细菌总数为5.22×10-1.38×10 copies/mL。长江和嘉陵江细菌群落在门水平上群落组分差异不大，但嘉陵江细菌群落多样性与丰富度较低。废水排放与流态变化对水质、细菌群落多样性指数、细菌总数均没有显著影响。但是污水厂排水对细菌群落结构有显著影响，引起Sporichthyaceae显著增加和Burkholderiaceae显著减少。研究河段细菌群落具有丰富的降解外源物质的功能基因，污水厂排水井未导致该类功能基因数量的变化。

关键词：长江；嘉睦江；城市河流；细菌群落；功能基因

中图分类号：X171 文献标志码：A

前言

细菌在水体中降解转化污染物，改善水体环境，同时水环境变化变化会对菌群的构成和多样性造成影响。因此细菌群落组成常被用作监测和预测一个水生生态系统健康与否的标准。

长江流域是中国重要的水资源，沿岸污水的排人会引相关水质参数的变化，可能导致菌群的改变。水体自净作用中的物理净化、悬浮颗粒的吸附与河流水动力特性有关，因此流态变化可能导致水质和菌群改变。此外，研究发现污水厂排水是河流致病菌的重要来源。对国内外多条河流的致病菌调查显示，污水厂排水增加了受纳水体中多种致病菌的丰度。长江、嘉陵江两岸人口密集，排污量大，两江的菌群稳定性关系到该区域的水环境质量。目前对长江微生物群落的研究内容主要针对特定区域微生物群落的构成和分布特征，对于人类活动和水流运动的影响研究较少。

研究于2019年8月下旬在长江和嘉陵江部分河段采样，基于16S rRNA高通量测序和QPCR技术，分析水体细菌群落特征及其与环境因子的关系，探究水流运动和污水厂排水影响下菌群的变化；借助PICRUSt功能预测分析，研究细菌群落功能基因的构成，为评估长江水生态状况和合理规划人类活动提供科学理论依据。

1材料与方法

1.1研究区域样品采集与水质理化指标测定

2019年8月22日在重庆城区长江与嘉陵江汇合河段至鸡冠石污水厂下游共设置11个采样点，如图1所示。鸡冠石污水厂是重庆市最大、全国第五大污水厂，日处理能力为80万吨，污水处理量占重庆主城污水处理量的55%。在每个采样点采集2L表层水体，其中1L用于高通量测序，1L用于水质指标测定。采样现场记录水温和采样点坐标，同时，使用ST300D型便携式溶解氧仪检测溶解氧（DO），PHB-4型便携式pH计检测pH。水样采集后冷藏运回实验室进一步处理分析。1L水样经孔径为0.22 um的无菌微孔滤膜过滤，滤膜在-20℃下冷冻保存。总氮（TN）、总磷（TP）和化学需氧量（COD）按《水和废水监测分析方法》（第四版）进行检测。采用tecplot软件对河段流场数据进行模拟得出各采样点流速。

1.2样本DNA提取、PCR扩增及高通量测序

滤膜样本送至上海美吉生物医药科技有限公司，采用FastDNASPINkitforsoil（MPBiomedicals，USA）试剂盒提取样本DNA。DNA完整性检测使用1%琼脂糖凝胶电泳，DNA浓度、纯度检测均采用NanoDrop2000（ThermoFisherScientific，USA）.送检的样本经检验满足：有明显条带，且清晰完整，无降解；OD260/280在1.58-2.08之间。采用细菌通用引物338F-806R对16SrRNA基因的V3-V4区进行PCR扩增。扩增的反应条件：95℃预变性5 min；95℃变性30 s，60℃退火30 s，35个循环；72℃延伸1 min。PCR扩增反应体系为20 uL，其中含：5×FastPFuBuffer4 uL，2.5 mMdNTPs2 uL，正反向引物各0.8 VL（5 uM），FastPFu聚合酶0.4 uL，牛血清蛋白（BSA）0.2 uL，模板DNA10 ng，用双蒸水补至20 uL。采用上海美吉生物医药科技有限公司的MiSeqPE300测序仪（Illuminalne，SanDiego，CA，USA）进行序列测定。原始数据已上传至美国国立生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）序列读取存档（sequence read arcruve，SRA），数据所属登录号为：PRJNA663032。

1.3测序数据分析

对原始数据进行拼接、过滤，得到有效数据，然后在97%相似度下用Usearch（verSlon7.0）进行OTU聚类，并将OTU代表序列比对SILVA数据库（Release132，http：//www.arb-silva.de）进行物种分类学分析。利用Mothur（Versionl.30.1）计算样本的a多样性指数（Shannon、Simpson、ACE、Chaol和Coverage）。采用QUME计算样本的unweightedUniFrac多样性矩阵，然后用R语言绘制PCoA图，ANOSIM分析检验组间差异显著性。为探究细菌群落与环境因子的关系，利用R语言进行冗余分析（RedundancyAnalysis，RDA）。功能预测采用PICRUSt软件进行分析，将OTU表与KEGG（KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes）数据库进行比对，获得功能预测信息，具体分析步骤基于在线分析平台（http：//pioust.github.io/picrust/）。

1.4细菌总数qPCR定量

细菌总数通过qPCR进行计数，总细菌数的DNA片段扩增使用正向引物1369F：5-CGGTGAATACGT-TCYCGG-3，反向引物1492R：5-GGWTACCITGT-TACGACW -3，退火温度为55℃。qPCR反应采用三个平行样，每个反应体系为10 uL，包括5uL的2×PremixExTaq，200 nM每种引物，0.1 uL的50 xROX作为参照染料以及1 uL的DNA模板。空白对照包含所有相同的反应试剂，但是用1 uL的无菌水替代DNA模板。制备DNA标准品每次上样同时做标准曲线（r2>0.99）。记录标准品扩增效率，每次扩增效率相似，为91%-99%，具体数值取决于实际试验。

1.5统计分析

利用IBMSPSSStatistics26进行统计分析。Shapiro-Wilk检验用于检验数据是否符合正态分布。t检验用于检验符合正态分布的两组数据的差异显著性。Mann-WhitneyU检验用于检验不符合正态分布的两组数据的差异显著性。

2结果与分析

2.1水体理化指标分析

各采样点水质理化参数如表1所示。各水质参数随采样点位置不同而有所差异，水温的变化可能主要来自于采样时间的不同（采样时间跨度为早上到下午）。pH较为稳定。总氮浓度较高，总磷浓度低。COD的最高值出现在长江和嘉陵江未汇合前，随着二者的汇合，COD下降了49%，这可能是由于水量的增大稀释了COD浓度。COD在S5、S7和S8均出现升高，前者可能是由于污水厂的排水，后两者可能由于河道的突然变窄，而后随着水流，COD值总体呈下降趋势。t检验结果表明，污水厂上下游的水质参数不存在显著差异（p>0.05）。一些采样点（S7、S9）的流速较低（0.2m/s左右），但并未出现有机物和营养盐的浓度高值。近年来，氮磷，尤其是磷，已成为影响长江水质的主要污染物质。而在研究河段，除了总氮的浓度较高外，其它水质参数均达到Ⅱ类水质标准。

2.2细菌群落多样性指数分析

11个样品共得到617 952条高质量序列，每个样品32 858～74 136条序列。依据97%相似度划分，共得到1 278条OTUs，每个样品的OTU数目为644-897。通过评估各样品的细菌群落多样性指数（如表2所示），表明嘉陵江（S2）水体中细菌群落多样性（Shannon指数：3.44）和丰富度（Chaol指数：643.04）都低于长江水体（除S2号点以外的10个样本点）细菌群落的多样性（Shannon指数：4.31-4.72）和丰富度（Chaol指数：942.52-1 172.60）。长江水体的细菌群落多样性（Shannon指数：0.56-5.42）和丰富度（Chaol指数：137-12 601）在较大范围变动，该河段的细菌群落多样性和丰富度较为稳定。t检验结果显示，污水厂上下游水体的细菌群落多样性指数不存在显著性差异（p>0.05），各流态、流速不同的采样点细菌群落多样性指数也不存在显著性差异（p>0.05）。

2.3细菌群落组成分析

长江水体中优势细菌门类有：放线菌门（Actinobactena，41.02%-54.15%）、变形菌门（Proteobacteria，22.51%-35.18%）、拟杆菌门（Bacteroidetes，9.56%-14.60%）和蓝细菌门（Cyanobactena，4.70%-13.30%）（如图2所示）。嘉陵江水体中细菌群落构成与长江水体相似，差异在于放线菌所占比例更高（68.78%）。这些细菌都是河湖等淡水水体中的典型细菌，长江和嘉陵江的细菌群落已被发现主要由这些细菌门类以及厚壁菌门（Firmicutes）构成，但各门类的比例随采样时间和位置存在差异。

2.4细菌群落构成相似性分析

利用PCoA分析各样本的细菌群落构成相似度（如图3所示）。对鸡冠石污水厂排水口上下游样品进行分组，上游S1、S3、S4为Gl组，下游S5至S11为G2组。PCoA分析表明，G2组样品（S5-S11）成聚集状态，说明G2组各样本的细菌群落构成较为相似，不受流速、流态变化的影响。Gl组S2和S3聚集，而S1与S2、S3较为分散，可能是因为Sl在嘉陵江汇人前，S2、S3在嘉陵江汇入后，嘉陵江的汇人引起了细菌群落结构的变化。通过ANOSIM相似性分析进一步发现，污水厂排水口上下游的细菌群落结构存在显著差异（p<0.05）。沈杰等也研究发现污水厂上下游的微生物群落构成存在显著性差异，表明污水厂排水对河流微生物群落有影响。

2.5细菌群落构成与环境园子关系

应用RDA分析细菌群落构成与环境因子的关系（如图4所示）。结果表明，对研究河段细菌群落影响最大的环境因子是pH，其次是COD，然后是温度，总磷（TP）对细菌群落的影响最小。pH与COD、温度呈负相关，COD与温度呈正相关。放线菌门（Actinobacteria）与水温、流速和COD呈正相关关系，与TP、DO、pH呈负相关关系。变形菌门（Proteobacteria）和拟杆菌门（Bacteroidetes）与pH、DO、TP正相关，与COD、流速、水温负相关。蓝细菌门（Cyanobacteria）与COD、pH、DO呈正相关关系，与TP、TN、水温、流速负相关。河流微生物群落受到气候、水文、营养物质等众多环境因子的共同影响。研究没有水文气象条件变化，主要分析水质指标对河流微生物群落的影响。

2.6显著性差异物种分析

对鸡冠石污水厂上下游丰度差异显著的物种进行分析。在科分类水平上，共有2个科的细菌存在显著丰度差异，主要为孢鱼菌科（Sporichthyaceae）和伯克氏菌科（Burkholderiaceae）。相比污水厂上游，Sporichthyaceae在污水厂下游显著增加，而Burkholderiaceae显著减少。Sporichthyaceae属于放线菌，研究发现其通过降解颗粒有机物进行生长，能够在不利条件下生存，同时对环境的变化有很好的适应能力。Burkholderiaceae属于变形菌，包括了很多的人类和动物致病菌以及条件致病菌。

2.7功能基因预测分析

利用PICRUSt预测的各样品KEGG通路包括代谢、遗传信息处理、细胞过程和环境信息处理等几个功能组。其中，代谢通路所占比例最高（69.5%71.2%）。代谢通路中外源物质的降解和代谢功能基因与细菌对污染物的降解有关，所有样品具有的该类别功能基因中基因数最高的包括苯甲酸盐（Benzoate降解基因、氨基苯甲酸盐（Aminobenzoate）降解基因、己内酰胺（Caprolactam）降解基因以及氯代烷烃（Chloroalkane）和氯代烯烃（Chloroalkene）降解基因。各样品相比较，嘉陵江细菌群落（S2）具有的降解和代谢外源物质的功能基因数最多。结果表明，除了阿特拉津（Atrazine）和DDT降解基因外，其它各外源物质降解代谢基因的相对丰度均为嘉陵江细菌群落（S2）最高。污水厂下游除了S7的污染物降解功能基因相对丰度较高外，没有发现污染物降解基因的明显富集。有研究发现，有毒化学物质的存在会增加微生物的代谢酶和代谢路径。但是，污染物降解功能基因丰度和污染物浓度的关系还尚不明确，需要进一步的研究。

3结语

嘉陵江和长江水体均具有丰富的浮游细菌，细菌总数达到5.22×10-1.38×10 copies/mL，细菌群落构成主要包括放线菌门、变形菌门、拟杆菌门和蓝细菌门。嘉陵江菌群丰富度和多样性低于长江，但放线菌在菌群构成中具有更高的比例。污水厂排水对细菌群落结构造成了显著影响，引起Sporichthyaceae显著增加和Burkholderiaceae显著减少。河流流速、流态变化并未引起水质、菌群多样性指数、群落结构和细菌总数的显著变化，表明细菌群落不受水流运动的影响。影响研究河段细菌群落的主要环境因子有pH、COD和水温。PICRUSt功能预测分析表明，嘉陵江细菌群落具有最多的外源物质降解和代谢功能基因，对于大部分外源物质，其降解和代谢的功能基因的相对丰度也最高。污水厂排水并未导致该类功能基因的富集。