假肺炎链球菌的鉴定及耐药性分析

林晓晖 陈东科 简梦华 陈伟明

摘要：目的 了解假肺炎链球菌的鉴定方法及耐药性分析。方法 收集广州市番禺区中心医院4株假肺炎链球菌，用Optochin敏感试验，胆汁溶菌试验，肺炎链球菌的胶乳凝集试验， Vitek2 Compact，Vitek MS质谱仪， 16S rRNA基因测序进行鉴定。并对35株假肺炎链球菌进行药敏试验。结果 假肺炎链球菌的optochin敏感性试验，Vitek2  Compact在不同培养条件下结果不尽相同；肺炎链球菌胶乳凝集试验全部为阳性；在CO2条件下培养的菌株用Vitek MS质谱仪鉴定全部为假肺炎链球菌；16S rRNA无法区分假肺炎链球菌，肺炎链球菌及缓症链球菌三种菌群。35株假肺炎链球菌的药敏试验的结果阿齐霉素、红霉素、克林霉素全部显示为耐药率为88，6%，85.7%及80%。左氧氟沙星等7种抗菌药物全部显示为敏感。结论 比较假肺炎链球菌的不同鉴定方法及其药敏特点，为临床鉴定和治疗假肺炎链球菌的提供快速简便准确的方法。

关键词：假肺炎链球菌； 耐药性；VITEK MS 质谱仪；Optochin敏感试验；胆汁溶菌试验；16S rRNA基因测序

中图分类号：R978.1         文献标志码：A         文章编号：1001-8751（2023）04-0276-05

Identification of Streptococcus pseudopnemoniae and Resistance Analysis

Lin Xiao-hui1， Chen Dong-ke2 ， Jian Meng-hua1， Chen Wei-ming1

（1 Guangzhou Panyu Central Hospital，   Guangzhou  511400;  2 Beijing Hospital，    Beijing   100730）

Abstract：Object To know the identification of Streptococcus pseudopnemoniae and resistance analysis. Methods To collect Streptococcus pseudopnemoniae of Guangzhou Panyu Central Hospital， Optochin susceptibility test， bule resolution est， Latex agglutination test and Vitek2 Compact， Vitek MS， and 16S rRNA were applied. To test the sensitivity of this drug， 35 Streptococcus pseudopnemoniae were proposed. Results The result of the Optochin susceptibility test is that， in different conditions， Vitek2 Compact is different. Latex agglutination test was positive， and Streptococcus pseudopnemoniae were identified by Vitek MS， when it grows in CO2. 16S rRNA cant divide Streptococcus pseudopnemoniae， Streptococcus pnemoniae and Streptococcus mitis. Azithromycin， erythromycin and clindamycin resistance rates were 88.6%， 85.7% and 80%. Levofloxacin and the other 7 kinds of antibiotic-sensitive rates were 100%. Conclusion Compared with different identification ways of Streptococcus pseudopnemoniae， the aim of this method is to find a more convenient， simple and accurate way for identification.

Key words：Streptococcus pseudopnemoniae； resistance；Vitek MS；optochin susceptibility；bule resolution test；16S rRNA

目前链球菌属包含的菌种有100余种，草绿色链球菌（α-溶血的链球菌）可分为10余种，其中对人体致病有缓症链球菌群，咽峡炎链球菌群，变异链球菌群，唾液链球菌群和牛链球菌群5个草绿色链球菌种群[1-2]。在α-溶血的链球菌当中，假肺炎链球菌与肺炎链球菌高度类似，几年前已从肺炎链球菌中划分开，独立成种[2-3]， 假肺炎链球菌的菌株常分离于下呼吸道感染的患者[2-4]。另外，本研究发现假肺炎链球菌的药敏试验，因其在现有的商品MIC药敏板上生长不良或不生长，只能选择在血MH平板上进行纸片扩散法（K-B法），同时，其药敏判断折点的选择为α-溶血的链球菌的药敏折点；而肺炎链球菌无论在药敏方法（MIC法）及药敏折点的选择均与之不同。因此，本研究对近年广州市番禺区中心医院分离的假肺炎链球菌进行了鉴定及药敏分析，并以此找到假肺炎链球菌的鉴定及治疗方法。

1 对象和方法

1.1 研究对象

广州市番禺区中心医院35株住院送检的痰标本中分离的假肺炎链球菌。

1.2 试剂来源

药敏纸片，胶乳试剂由英国Oxoid公司提供。血M-H平板购自广州迪景公司，鉴定试剂为法国生物梅里埃公司的质谱仪及相应配套靶板和基质液以及Vitek2 Compact及相应配套的GP鉴定卡。E试验试条购自温州康泰生物公司。

1.3 仪器设备

法国生物梅里埃公司的质谱仪Vitek MS以及Vitek2 Compact、药敏纸片分配器、恒温培养箱。

1.4 细菌培养与鉴定

细菌分离培养严格按照《第四版全国检验操作规程》进行。细菌鉴定由法国生物梅里埃公司的Vitek MS质谱仪或Vitek2 Compact进行。

1.5 Optochin敏感试验

配制0.5麦氏单位菌液，用无菌棉签均匀涂布于含5%羊血MH平板上，10 min贴Optochin纸片，放35 ℃孵箱或35 ℃ CO2孵箱温育过夜。抑菌环直径≥14 mm为敏感。

1.6 胆汁溶菌试验

试管法：分别取1 mL 6麦氏单位菌液于2个试管中，于1管菌液中加0.1 mL 10%胆盐溶液，另一管加0.1 mL无菌生理盐水，混匀后，置35 ℃孵箱温育    15 min，摇匀观察结果，加盐水管菌液浊度不度，加胆盐溶液管菌液变澄清，判为胆汁溶菌试验阳性[5]。

1.7 肺炎链球菌的胶乳凝集试验

取几个菌落与1滴缓冲液在试验纸板上试验区域充分均匀研磨，将此菌液与结合在纸板上的胶乳试剂充分均匀研磨，出现细沙粒凝集为阳性。

1.8 16S rRNA基因测序

将4株纯培养的假肺炎链球菌进行16S rRNA基因测序。

1.9 药敏试验

假肺炎链球菌的药敏试验均使用纸片扩散法（K-B法）进行。取分纯后的假肺炎链球菌配制成0.5麦氏比浊的菌液，均匀涂布于血M-H平板上，再使用药敏纸片分配器贴上左氧氟沙星、阿齐霉素、头孢噻肟、头孢曲松、利奈唑胺、喹奴达丁/达福普汀、红霉素、克林霉素、四环素、氯霉素、万古霉素、头孢吡肟等药敏纸片，青霉素则用E试验试条进行药敏试验，置35 ℃ CO2孵箱中培养24 h后量取抑菌环的直径，药敏标准根据2021版CLSI判断结果。

1.10 质控菌株

质控菌株为肺炎链球菌ATCC49619和金黄色葡萄球菌ATCC25923。

1.11 数据处理

采用Excle进行统计及分析。

2 结果

2.1 患者资料

共收集2017—2021年广州市番禺区中心医院住院感染假肺炎链球菌35株，菌株分离自35例患者，全部来自痰标本。35株假肺炎链球菌分别来自ICU，16株；呼吸内科，6株；儿科，4株；心胸外科，3株；感染疾病科，3株；血液科，1株；急诊科，1株；综合病区1株。其中年龄>80岁有7株，>60岁有21株，<1岁4株。男性有29株，女性6株。痰涂片的结果均显示为合格的标本，上皮细胞<10个/低倍视野，镜下可见成双，矛头状，钝端相对的革兰阳性球菌且部分有白细胞吞噬现象。35株假肺炎链球菌全部用Vitek MS质谱仪进行鉴定，其中4株用于鉴定比较假肺炎链球菌，其中2株来自于呼吸内科，另外两株分别来自ICU及儿科。4例患者有呼吸道感染，其中两例为慢性阻塞性肺病的患者。上述4株菌株是采用Vitek MS质谱仪在2017年9月至2018年1月初次分离的4株符合诊断标准的假肺炎链球菌。因这是本院微生物室首次从临床上分离此菌，为了明确准确地鉴定结果，从而找出快速简便准确的方法，所以本研究对此4株菌进行不同条件下用6种方法地进行比较鉴定。另外，在进行药敏试验时，提示假肺炎链球菌如采用常规肺炎链球菌的药敏方法，发现其生长不良或不生长，遂改用了α-溶血的链球菌的药敏方法。为了得到更多的药敏数据，收集了35株假肺炎链球菌进行统计。

2.2 菌落镜下形态

痰涂片革兰染色直接镜检：痰涂片的结果显示上皮细胞<10个/低倍视野，均为合格的标本，镜下可见成双，矛头状，或呈短链排列的革兰阳性球菌（白色箭头所指，见图1）。菌落形态：钝端相对的革兰阳性球菌且部分有白细胞吞噬现象。血平板上可见α-溶血，草绿色溶血环较宽大，48 h可见脐窝状菌落（见图2）。

2.3 CO2环境及大气环境下Optochin敏感试验

4株假肺炎链球菌的Optochin敏感试验的结果，4株菌株在CO2环境培养的Optochin敏感试验均显示为耐药（9～13mm），但在大气环境培养的菌株的Optochin敏感试验却有3株显示为敏感，一株显示为耐药（10mm）。结果见表1。

2.4 胆汁溶菌试验的结果

4株假肺炎链球菌的胆汁溶解试验均为加胆盐溶液管菌液与盐水对照管相比有50%浊度变化，不能确定胆汁溶解试验的阴阳性。结果图3及表1。

2.5 肺炎链球菌的胶乳凝集试验

4株假肺炎链球菌的肺炎链球菌胶乳凝集试验均呈现凝集试验阳性（结果见表1）。

2.6 厌氧环境及CO2环境下Vitek2 Compact的鉴定结果

4株假肺炎链球在厌氧环境及CO2环境下35 ℃温箱中培养24 h，用Vitek2 Compact的GP卡进行鉴定，厌氧环境下鉴定为毗邻颗粒链，多动物链球菌肺炎链球菌麻疹孪生球龋齿罗斯菌等菌种，CO2环境下培养的菌株鉴定的结果有缓症/口腔链球菌，肺炎链球菌，星座链球菌咽峡炎亚种等菌种，鉴定结果见表1。

2.7 厌氧环境及CO2环境下Vitek MS质谱仪的结果

4株菌株的用Vitek MS质谱仪厌氧环境下培养下的菌株为假肺炎链球菌，缓症/口腔链球菌及肺锬链球菌等菌种，在CO2环境下培养的菌株全部鉴定为99%的假肺炎链球菌，结果见表1。

2.8 16S rRNA基因测序的结果

4株假肺炎链球菌16S rRNA基因测序的结果是假肺炎链球菌，肺炎链球菌，缓症链球菌无法区分，结果见表1。

2.9 35株假肺炎链球菌的药敏结果

35株假肺炎链球菌在体外药敏试验中对13种抗菌药物敏感性，其中阿齐霉素、红霉素、克林霉素全部显示为耐药率为88.6%，85.7%及80%。而左氧氟沙星、利奈唑胺、头孢曲松、头孢噻肟、万古霉素、氯霉素及青霉素全部显示为敏感，则具体药敏结果详见表2。

3 讨论

近年在微生物检验工作中发现了一种α-溶血，48 h后可见脐窝状，但菌落较正常肺炎链球菌干燥的菌株。痰涂片结果显示为合格标本，同时存在白细胞吞噬现象，证明此菌为感染菌。只有正确的鉴定才能以此为依据选择相应的药敏标准进行药敏试验。为此，本研究收集了菌株进行了一系列的实验对它们进行鉴定，以便找出临床上简单方便准确的方法。

从表1可以看出，对于Optochin敏感试验，4株菌株在 CO2环境培养的Optochin敏感试验均显示为耐药，但在大气环境培养的菌株的Optochin敏感试验却有3株显示为敏感，一株显示为耐药。大气环境培养下的Optochin敏感性试验则已作为假肺炎链球菌的初筛试验。但因日常肺炎链球菌的Optochin敏感试验要求在CO2环境下进行，即使本研究中CO2环境培养的Optochin敏感试验均显示为耐药，但其抑菌环直径介乎于9～13mm之间，结合菌落特征，我们也不能忽视其可作为假肺炎链球菌的初筛试验的可能性。而胆汁溶菌试验的结果则显示为加胆盐溶液管菌液与盐水对照管相比有50%浊度变化。不能确定胆汁溶菌试验的阴阳性，这与Keith等[4]的报道不尽相同。故本研究中的胆汁溶菌试验不能作为假肺炎链球菌的鉴定试验。

同时本研究对4株菌株进行了的肺炎链球菌的胶乳凝集试验，4株菌株结果均显示为阳性。可见肺炎链球菌的胶乳凝集试验不能区分肺炎链球菌及假肺炎链球菌。另外，表1显示用Vitek2 Compact 的GP卡进行鉴定为缓症/口腔链球菌或其他链球菌属，但在厌氧培养及CO2环境培养用Vitek2 Compact 鉴定的结果却不尽相同。说明GP卡并不能很好鉴定肺炎链球菌及假肺炎链球菌，缓症/口腔链球菌或其他链球菌属。本研究用Vitek MS质谱仪进行鉴定，在CO2环境培养的菌株结果全部显示为99%假肺炎链球菌；但这4株菌株在厌氧培养24 h后再Vitek MS质谱仪进行鉴定，则会出现50%为假肺炎链球菌，50%为缓症/口腔链球菌或其他链球菌属的结果，说明不同条件培养对质谱的结果也有一定的影响。本研究中显示在CO2环境培养的菌株对Vitek MS质谱仪的鉴定假肺炎链球菌更为合适。

16S rRNA基因测序的结果为缓症链球菌，假肺炎链球菌及肺炎链球菌，三者相似率大于>99%，16S rRNA 区分菌种的标准>99%被认为属于同一菌种，说明16S rRNA目前无法区分这三种菌群[6]。

患者资料显示35株菌株均分离自下呼吸道感染的患者，其中年龄>80岁有7株，>60岁有21株， <1岁 4株，显示假肺炎链球菌的感染可能与年龄及呼吸道感染等易感因素有关。另外，从表2我们可以看到，药敏的结果显示阿齐霉素、红霉素、克林霉素全部显示为耐药率为88.6%，85.7%及80%，而左氧氟沙星、利奈唑胺、头孢吡肟、头孢曲松、头孢噻肟、万古霉素、氯霉素及青霉素全部显示为敏感，这与文献[7]报道的肺炎链球菌对青霉素、头孢曲松头及孢噻肟的药敏结果不同，故准确的菌种鉴定及正确的药敏试验对临床治疗是很有参考依据的。

综上所述，比较几种不同的假肺炎链球菌的鉴定方法的特点及结果，几种方法各有优劣，但相同的是不同的培养条件对假肺炎链球菌的鉴定有一定的影响。本研究中，Optochin敏感性试验可以作为假肺炎链球菌的初筛试验，而CO2环境培养的菌株Vitek MS质谱仪的全部鉴定为假肺炎链球菌。两者结合为现时临床中快速简便准确鉴定假肺炎链球菌的最适方法。但由于用于比较的菌株较少，还有待更多的验证。与此同时，这也说明细菌鉴定的临床微生物检验应综合多种方法，并找到合适的条件，才能准确鉴定到种。另外，也只有准确地鉴定到种，才能以此选择正确的药敏试验，为临床用药提供准确的依据。

参 考 文 献

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