ATP7Bp.Ser1369Tyrfs*24突变致肝豆状核变性1例报告

刘玉婷 唐志慧 宾琼

关键词：肝豆状核变性; 高通量核苷酸序列分析; ATP7B基因

基金项目：广西自然科学基金（2018JJB140029）;  广西医疗卫生重点学科项目

A case of hepatolenticular degeneration caused by ATP7B p.Ser1369Tyrfs*24 mutation

LIU Yuting， TANG Zhihui， BIN Qiong. （Department of Pediatrics， The Affiliated Hospital of Guilin Medical University， Guilin， Guangxi 541001， China）

Corresponding author：

BIN Qiong， binqiong1386@126.com （ORCID：0000-0002-0555-4219）

Key words：

Hepatolenticular Degeneration; High-Throughput Nucleotide Sequencing; ATP7B Gene

Research funding：

Natural Science Foundation of Guangxi Province （2018JJB140029）; Guangxi Medical and Health Key Disciplines

肝豆状核变性又称Wilson病（Wilsons disease， WD），是由一种铜代谢障碍所致的常染色体隐性遗传病，其发病机制主要是位于第13号染色体长臂（13q14.3～q21.1）上的ATP7B基因突变，导致ATP7B蛋白功能障碍引起铜排泄障碍，进而造成铜大量沉积于组织器官，尤以肝脏、大脑多见［1］。目前WD全球患病率为1/5 000～1/30 000，ATP7B突变基因携带率为1/90［2-3］，该疾病主要通过血清铜蓝蛋白、24 h尿铜、青霉胺负荷试验、肝细胞含铜测定及基因测序等检查进行辅助诊断［1］。WD是一种早发现、早诊断、早治疗可有效遏制疾病进展、预后良好的遗传性疾病，因此早期诊断和治疗可大大减少该病的致残率及死亡率。本文通过对先证者及其家系的基因检测并结合相关辅助检查，明确了患儿及其胞兄WD的诊断，进一步丰富了ATP7B基因突变谱。

1 病例资料

先证者，患儿男性，5岁3月龄，1年前因体检发现肝功能异常，未予处理。于2021年11月以“发现肝功能异常1年”为主诉至本院儿科住院。查体：肝肋下4 cm可触及，质韧，边钝，无压痛，余无特殊。完善WD相关检查：肝功能示总胆红素4.95 μmol/L，丙氨酸氨基转移酶180.59 U/L，天门冬氨酸转移酶119.6 U/L；铜蓝蛋白5.9 mg/dL；24 h尿铜92.7 μg；头颅MRI未见明显异常；腹部MRI提示脂肪肝，肝肋下4 cm；眼部检查提示双眼上方角巩膜缘见血管翳，下方角巩膜缘见少量色素沉着，裂隙灯检查未见明显角膜色素环（K-F环）；其余检查：凝血功能示纤维蛋白原1.71 g/L；凝血因子检测示多种凝血因子活性降低，其中凝血因子Ⅱ活动度54.5%，凝血因子Ⅸ活动度60.3%，凝血因子Ⅹ活动度65.1%，凝血因子Ⅺ活动度62.9%；肝炎病毒、巨细胞病毒核酸、自身免疫性肝病相关检查均未见异常。追问家族史，先证者胞兄亦有长期肝功能异常病史，检查铜蓝蛋白5.0 mg/dL，父母否认肝功能异常，因此建议该家族完善WD相关基因检测。采集先证者、父母及兄长外周血2～3 mL，根据核酸提取及纯化试剂（博奥木华）操作说明书要求，从外周血中提取基因组DNA。采用QIAseq FX DNA Library Kit试剂盒及定制的单基因病panel，制备包含ATP7B基因全部外顯子及剪切区域的文库，采用AMPure XP beads纯化体系进行纯化并采用Quant-iTTM 1X dsDNA HS Assay Kit和QubitTM荧光计对文库进行定量检测。采用NadPrep NanoBlockers（for Illumina）、NadPrep Hybrid Capture Reagents、KAPA Library Amplification、NovaSeq 6000 Reagent试剂盒，按照操作说明书要求，对先证者文库杂交捕获并进行捕获后产物的扩增、纯化并在NovaSeq 6000测序仪上进行高通量测序。与hg19的参考序列和基因组分析工具包进行比对，进行变异调用。使用ANNOVAR工具对变异进行分析，该工具包含注释数据库，如1000基因组数据库、dbSNP数据库、ClinVar数据库、多态性表型v2数据库以及SIFT数据库。对先证者的可疑致病位点设计相应引物，进行Sanger测序验证。扩增区域1∶chr13∶52523855+52524461，对应的引物序列正向为CAACGTCAAAGTTGACATGATG，反向为TGGATGGGAAAGTCCTGG；扩增区域2∶chr13∶52509545+52510015，对应的引物序列正向为AATTGCCTGCTCATGGTG，反向为CAGCTTTCTAGGAAGCCTCAC，扩增长度为500 bp。采用ABI9700 PCR仪进行扩增，PCR扩增条件如下：95 ℃变性5 min，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30个循环，最后72 ℃延伸10 min。产物纯化后用ABI3730基因分析仪进行双向测序，Sequencher软件分析测序结果。

先证者家系遗传图及基因测序结果如图1所示，先证者的ATP7B基因编码区存在2个变异，其中遗传自母亲的c.2662A＞C（p.Thr888Pro）为ATP7B基因编码区的错义变异（图1a），该基因位点突变最近已有文献［4-5］报道为WD的致病突变，且与现有文献［6-8］报道的WD致病突变（p.Ile1148Thr；p.Pro992Leu）呈反式排列，故该变异确定为致病变异。另一变异遗传自父亲的c.4106delC（p.Ser1369Tyrfs*24）为ATP7B基因编码区的移码变异（图1b），该变异目前未见ATP7B基因变异数据库和文献报道，为新发突变。同时，先证者兄长的ATP7B基因测序结果同先证者，突变位点详见表1。通过基因分析可见，该家系中父亲的ATP7B基因发生c.4106delC缺失突变，引起第1369位点发生移码突变，由丝氨酸突变为酪氨酸，并继续编码23个氨基酸后终止。此突变理论上导致该基因编码氨基酸序列的提前终止，该变异下游仍有多个无义变异致病的报道［9-11］，提示该变异所致氨基酸序列缺失部分对蛋白质功能有重要作用。先证者和兄长均有WD的表型，基因测序结果显示二者基因型相同，根据遗传图谱分析（图1c），父母分别携带1个突变，2个小孩均遗传了2个突变，符合常染色体隐性遗传模式中复合杂合突变致病的机制。根据以上证据，ATP7B c.4106delC（p.Ser1369Tyrfs*24）考虑为新发的致病突变。

2 讨论

WD发病可见于任何年龄，但多起病于儿童及青少年期［12］，根据临床症状可分为以下分型。（1）肝型：WD中最常见类型，该型多见于儿童及青少年，以肝损伤为表现，可见进行性转氨酶升高、急性或慢性肝炎、脂肪肝、肝硬化甚至急性肝衰竭，但也可以无症状表现。（2）脑型：以神经系统症状为主，常较肝型发病晚10年，可出现智力倒退、构音障碍、吞咽障碍、运动障碍、不自主运动、震颤、精神症状，该型症状轻时不易发现，察觉时已进入中后期。（3）其他型：如出现肾脏疾病、骨病、肌肉疾病、皮肤色素沉着、K-F环及溶血性贫血等。（4）混合型：以上各型的组合［1，13］。WD的诊断金标准为肝穿刺活组织检查肝细胞铜含量＞250 μg/g，但其为有创性检查，故临床应用较少［14］。目前该病主要通过临床表现结合辅助检查如生化指标、影像学及基因检测进行诊断，其中生化指标主要包括血清铜蓝蛋白＜200 mg/L、24 h尿铜＞100 μg，影像学例如腹部彩超、CT、MRI及头颅MRI（最常见的是基底节区或桥脑的改变）等。结合本病例，先证者为学龄前儿童，以肝脏病变为首发症状，出现转氨酶升高、多种凝血因子活动度降低、脂肪肝，肝大、血清铜蓝蛋白明显降低、尿铜升高等表现，因此考虑可能为肝型WD，为进一步验证，建议家属完善家系基因检测。

随着基因检测技术的不断进步，加之ATP7B基因突变位点的报道增加，基因检测成为WD的一线筛查方法。根据人类基因数据库记载，目前ATP7B基因发现有938个突变位点，种族、地域分布与突变的频率和种类显著相关，其中欧洲WD以c.3207C＞A（His1069Gln）为最常见的突变位点，基因频率为13%～61%，亚洲WD以c.2333G＞T（Arg778Leu）为常见突变位点，基因频率为34%～38%［13］。另外Cheng等［15］针对中国WD人群研究发现，肝型多见于p.Ser406Ala、p.Val456Leu突变，脑型多见于c.2755C＞G（p.Arg919Gly）、c.3443T＞C （p.I1e1148Thr）突变，而c.2804C＞T（p.Thr935Met）突变常表现为混合型。Li等［16］研究统计结果显示，WD先证者的直系兄弟姐妹患WD的概率为25%，而其子女患WD的概率为0.5%。在欧洲儿童WD诊疗指南［17］中也提出，一旦确诊WD，先证者的一级亲属（兄弟姐妹、后代及父母）均应完善肝功能、铜代谢指标及基因检测。

根据2001年德国莱比锡第8次WD国际会议上制订的Leipzig评分［18］，并结合本病例已完善的相关检查结果进行评分，先证者Leipzig评分为5分（24 h尿铜92.7 μg计1分，ATP7B基因外显子测序为复合杂合突变计4分），其兄长Leipzig评分为4分（ATP7B基因外显子测序为复合杂合突变计4分），两者总分均≥4分，故均诊断为WD。

综上，通过本病例研究明确了c.2662A＞C（p.Thr888Pro）及c.4106delC（p.Ser1369Tyrfs*24）突变位点为该家系患有WD的遗传因素，同时该家系的c.4106delC（p.Ser1369Tyrfs*24）移码突变为ATP7B基因新发突变位点，进一步丰富了ATP7B基因突变谱。年龄＜10岁的患者若以肝脏疾病为首发症状起病时，需警惕WD可能。对高度疑似及确诊的WD患者应進行直系亲属的WD筛查，以便于早发现、早诊断、早治疗，进而有效遏制疾病进展，减少该病的致残率及死亡率。

伦理学声明：本例报告已获得患者家属知情同意。

利益冲突声明：所有作者均声明不存在利益冲突。

作者贡献声明：刘玉婷负责撰写论文；唐志慧负责收集资料；宾琼负责指导撰写文章，修改文章及最后定稿。

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收稿日期：

2022-08-04；錄用日期：2022-09-05

本文编辑：葛俊