绞股蓝中总皂苷含量测定方法

许芳瑞，刘新艳，刘茜, ，杨宇，赵浩安，曹炜

1. 西北大学食品科学与工程学院（西安 710069）；2. 西安西大生命科学与健康研究院有限公司（西安 710069）

绞股蓝（Gynostemma pentaphyllum（Thunb.）Makino）是葫芦科绞股蓝属的多年生草质藤本植物，又名七叶胆、五叶参、小苦药等。从绞股蓝中分离的绞股蓝皂苷被认为是其药理活性和临床效应最重要的活性成分之一，因其具有和人参皂苷相同的四环三萜达玛烷型结构而备受关注，绞股蓝也是目前已知的非五加科人参属植物中唯一含有人参皂苷类成分的植物，其中皂苷XLIX和A是目前已知能够定量的绞股蓝皂苷。研究表明其具有降血脂[1]、抗癌[2]、抗氧化[3]、神经保护[4]等生物活性。随着绞股蓝的各项研究不断深入，开发利用逐渐广泛，绞股蓝中总皂苷的定量是绞股蓝开发利用的关键。不同产地、不同品种、不同采收期的绞股蓝中总皂苷的含量不同，有关绞股蓝的质量标准不够健全，绞股蓝中总皂苷含量测定方法也没有统一标准，使得绞股蓝的质量得不到保障，这严重影响绞股蓝及其产品的疗效。因此，试验对绞股蓝中总皂苷含量的测定方法进行研究，旨在提供一种简捷、准确、重复性好的绞股蓝总皂苷的含量测定方法，为绞股蓝开发利用的质量控制提供科学依据。

1 材料与仪器

1.1 试验材料与试剂

绞股蓝药材（购自陕西省平利县）；XAD-2大孔树脂、D-101大孔树脂（美国Sigma）；无水乙醇、正丁醇、香草醛、高氯酸、冰醋酸（均为国产分析纯）；人参皂苷Rb1（纯度≥98%，批号wkq18020808，四川成都维克奇生物有限公司）。

1.2 仪器与设备（表1）

仪器 设备型号 生产厂家电子分析天平 JM-B5002 余姚市纪铭称重校验设备有限公司小型粉碎机 XT-1000A 永康市红太阳机电有限公司低速大容量多管离心机 LXJ-Ⅱ 上海安亭科学仪器冷冻干燥机 FD1C50 北京博医康实验仪器有限公司超纯水制备仪 UPT-1-10T 四川优普超纯科技有限公司L5s紫外分光光度计 L5S 北京赛多利斯科仪器有限公司紫外可见分光光度计 722G 上海仪电分析仪器有限公司

1.3 试验方法

1.3.1 对照品溶液的制备

精密称定适量人参皂苷Rb1对照品，加甲醇溶解，制成2 mg/mL的对照品溶液备用。

1.3.2 供试品溶液的制备

取绞股蓝药材烘干，粉碎，过0.250 mm孔径（60目）标准筛。精密称定1 g绞股蓝粉末，置于圆底烧瓶中，加入50 mL 75%乙醇在80 ℃下回流提取2次，每次1 h。冷却后离心并合并提取液，将提取液采用旋转蒸发仪真空浓缩至干，残渣加水定容至100 mL容量瓶。取1 mL上清液，移入装有大孔吸附树脂的层析柱，用25 mL水洗柱，弃去洗脱液，用25 mL 70%乙醇洗脱，收集洗脱液转移至旋蒸瓶旋干，用5 mL甲醇溶解，过滤即得样品液。取1 mL转移至具塞试管，通过氮吹仪挥干，以此作显色用。

1.3.3 显色

溶剂挥干后，加入0.4 mL香草醛冰醋酸溶液，转动试管使残渣都溶解，加1.6 mL高氯酸，在60 ℃水浴10 min，取出冰浴冷却3 min，准确加入5 mL冰醋酸，摇匀后，在最大吸收波长处进行比色。

1.3.4 最大吸收波长的确定

将显色后的对照品和样品溶液在紫外可见分光光度计在400~800 nm波长范围内扫描，分别得到标准品与样品的可见光谱扫描图样，确定其最大吸收波长。

1.3.5 线性关系考察

精密量取20，40，60，80，100和120 μL人参皂苷Rb1标准溶液分别置于具塞试管中，在60 ℃氮吹仪挥干，按1.3.3的方法进行测定。以吸光度（A）为纵坐标，人参皂苷Rb1含量（mg）为横坐标进行回归计算，建立回归方程。

1.3.6 精密度试验

平行精密吸取6份0.1 mL人参皂苷Rb1对照品溶液置具塞试管中，于60 ℃氮吹仪挥干，按1.3.3的方法进行测定吸光度，并计算含量。

1.3.7 稳定性试验

取样品溶液分别于显色后10，20，30，40，50，60，70，80和90 min测定吸光度。

1.3.8 加样回收率试验

采用加标回收率法，平行吸取6份绞股蓝总皂苷提取液，分别加入样品总皂苷含量的50%，100%和200%的对照品溶液，各2份，按1.3.2的方法制备，以及按1.3.3的方法测定吸光度，按式（1）计算加标回收率，即以实际测得的样品中皂苷含量的增加量除以加标量。

1.3.9 重复性试验

取5份供试样品，每份精密称定1 g，按1.3.2的方法制备，按1.3.3的方法进行显色测定，在同一条件下记录吸光度并计算样品中的总皂苷含量。

1.3.10 不同绞股蓝样品中总皂苷含量的测定

取陕西省平利县不同批次的绞股蓝、绞股蓝茶，按1.3.2的方法提取纯化后，按1.3.3的方法比色，在550 nm波长处测定吸光度，根据所得到的标准曲线计算样品中绞股蓝总皂苷含量。

2 结果与分析

2.1 检测波长的确定

根据有紫外吸收的化合物在最大波长处测量组分的吸光系数最大，灵敏度最高，可以准确地反映被测化合物的特征，排除其他具有紫外吸收物质的干扰。因此，为确保试验结果的准确性，需要确定试验中绞股蓝总皂苷的最大吸收波长。

人参皂苷Rb1对照品溶液的光谱图如图1所示。结果显示，在550 nm波长处有最大吸收，这与齐敏杰[5]的结果相一致。

图1 人参皂苷Rb1对照品光谱图

2.2 标准曲线线性范围

以吸光度（A）为纵坐标，人参皂苷Rb1的含量（mg）为横坐标作图。如图2所示，试验中测定绞股蓝总皂苷含量的回归方程为y=3.872 3x-0.014，R2= 0.999 2，结果表明，绞股蓝总皂苷（以Rb1计）在0.04~0.25 mg范围内线性关系良好，设计合理。

2.3 大孔吸附树脂的选择

大孔吸附树脂是一种新型的非离子型高分子吸附剂，它能通过物理吸附选择性地吸附溶液中的有机物，实现分离纯化[6]。试验提取液分别通过D101大孔吸附树脂和XAD-2大孔吸附树脂进行纯化，采用D101树脂纯化的绞股蓝总皂苷含量为22.11 mg/g，XAD-2大孔吸附树脂纯化的绞股蓝总皂苷含量为15.52 mg/g，D101大孔吸附树脂纯化绞股蓝总皂苷提取率较高。

安如彬等[7]采用比色法，从富集、纯化苜蓿总皂苷的工艺参数及吸附量等方面，研究利用D-101大孔吸附树脂纯化苜蓿中的总皂苷工艺，结果表明D-101大孔吸附树脂具有较大的吸附容量，即使重复使用也可以得到较高的吸附量。这与试验所得到的结果相一致。

2.4 精密度试验结果

通过在1 d内连续6次对单一人参皂苷Rb1含量进行测定从而对精密度进行分析。分别对6份平行对照品溶液中的人参皂苷Rb1含量进行测定，结果如表2所示。样品的吸光度范围为0.330~0.350，含量范围为0.127 1~0.133 6 mg。经计算，上述方法的精密度的相对标准偏差（SRSD）为1.85%，表明上述方法重现性良好。

表2 精密度试验结果

2.5 显色稳定性试验结果

样品溶液显色后分别在15，30，45，60，75，100，115和130 min后测定吸光度，结果分别为0.344，0.325，0.324，0.321，0.321，0.319，0.316和0.313。由图3可得，溶液的吸光度基本趋于稳定，但随着时间的延长吸光度逐渐下降，因此尽量在短时间内完成测定。

图3 样品显色稳定性试验

2.6 重复性试验结果

通过比较6份同一绞股蓝样品在同一条件下测得的吸光度分析该测定方法的重复性，其吸光度及含量见表3。吸光度范围为0.393~0.421，绞股蓝样品总皂苷含量范围为2.17~2.31 mg。重复性试验结果的相对标准偏差（SRSD）为2.46%，表明该方法的重复性良好。

表3 重复性试验结果

2.7 加样回收率试验结果

经上述操作后，加样回收率结果见表4。吸光度范围为0.557~1.179，含量范围为0.179 4~0.372 1 mg，该测定方法的相对标准偏差（SRSD）为2.77%，说明该方法加样回收率高。

表4 样品回收率结果

2.8 不同绞股蓝样品中总皂苷含量

陕西省平利县不同批次的绞股蓝、绞股蓝茶、绞股蓝皂苷片中绞股蓝总皂苷含量见表5。平利县绞股蓝批次1和绞股蓝批次2的总皂苷含量分别为2.09 g/100 g和2.29 g/100 g，绞股蓝茶中总皂苷含量为4.45 g/100 g。绞股蓝茶中总皂苷含量是绞股蓝的2倍左右。

表5 不同样品中绞股蓝总皂苷含量

3 讨论

绞股蓝中的皂苷多为三萜皂苷，香草醛-冰醋酸溶液和高氯酸体系或浓硫酸常用作三萜皂苷的显色剂，且显色灵敏度高，显色原理是绞股蓝中的皂苷在强酸作用下脱氢，氧化后与香草醛缩合形成共轭结构，形成特征的紫红色[8]。样品的前处理过程对于比色法含量测定的准确性有着重要影响，试验在前人基础上得到[9]通过75%乙醇热回流提取绞股蓝中的总皂苷，提取率最高，在充分提取的基础上，并通过大孔吸附树脂对样品进行纯化，除去糖等水溶性杂质，减少杂质在比色中的干扰，也有研究采用正丁醇法提取纯化绞股蓝皂苷[10-11]，但步骤繁琐，而且耗时比较长，且有机试剂对操作者危害较大，通过大孔吸附树脂纯化皂苷提取液，不仅操作简单，而且能去除大部分杂质，同时通过比较D101和XAD-2树脂后发现，D101树脂对纯化效果较好。可能原因是D-101型大孔吸附树脂是聚苯乙烯型非极性共聚体树脂，适用范围较为广泛，对于不带极性的有机化合物普遍吸附能力较强，特别是对皂苷类的分离，效果尤佳[12]。

4 结论

采用75%乙醇热回流提取了绞股蓝中的总皂苷，通过D-101大孔吸附树脂对提取液中的总皂苷进行富集纯化，采用香草醛-高氯酸法比色体系测定了绞股蓝中的总皂苷含量。结果表明，人参皂苷Rb1在550 nm处有最大吸收，在0.04~0.2 mg有良好的线性范围，相关系数R2=0.999 2，平均加样回收率为102.65%，相对标准偏差（SRSD）为2.77%（n=6）。采用D-101大孔吸附树脂提取纯化绞股蓝皂苷的方法简单、准确、灵敏度高、重复性好，可用于绞股蓝中总皂苷含量的测定。试验为含有绞股蓝总皂苷的制剂分析与含量测定提供了一定的参考价值。