5-甲基异噁唑-4-甲酸肟酯衍生物的合成及抑菌活性

张文广, 刘函如, 魏志敏, 袁含笑, 王瑞龙,张洪艳, 张 璟, 李秀环, 雷 鹏*,,2,3

(1.西北农林科技大学 植物保护学院，陕西 杨凌 712100；2.旱区作物逆境生物学国家重点实验室，陕西 杨凌 712100；3.陕西省生物农药工程技术研究中心，陕西 杨凌 712100)

杂环异噁唑是一类含有氮、氧元素的五元杂环化合物，凭借着优良的生物活性及相对简单的合成方法，引起人们的广泛关注[1-2]。含异噁唑结构的化合物在医药领域具有较好的抗癌[3]、抗病毒[4]、抗炎[5]等活性，在农药领域表现出优良的除草[6]、杀虫[7]、杀菌[8]等活性，已商品化的农药分别有异噁唑草酮、噁唑磷和噁霉灵等，其中，噁霉灵为一种内吸性异噁唑类杀菌剂，对水稻立枯病和西瓜枯萎病等具有较好的预防效果[9]。

本课题组长期致力于绿色杂环农药的创制，前期设计合成了四氢喹啉[10-12]、吲哚[12]、吡唑[13-14]、噁二唑[15]等杂环类抑菌活性化合物。其中，含吡唑环的肟酯类化合物L1 对番茄灰霉病菌的EC50值为7.04 μg/mL，表现出较好的抑菌活性[13]。本文将L1 中的吡唑环用5-甲基异噁唑结构替代(图式1)，采用中间体衍生化法，设计合成了15 个新型5-甲基异噁唑-4-甲酸肟酯衍生物 (合成路线见图式2)，并评价其对4 种植物病原菌的抑菌活性。

图式 2 目标化合物的合成路线Scheme 2 Synthetic route of the target compounds

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Bruker AVANCE III 核磁共振仪 (500 MHz 或400 MHz，以TMS 为内标，CDCl3为溶剂)；X-6型数字熔点仪 (北京泰克仪器有限公司)；TripleTOF 5600 高分辨质谱仪 (AB SCIEX)；所有化学试剂(分析纯或化学纯) 均未经无水处理。

5-甲基异噁唑-4-甲酸 (纯度97%) 和97%肟菌酯 (trifloxystrobin) 原药，购自上海毕得医药科技股份有限公司。

1.2 化合物的合成

1.2.1 取代苯甲醛肟(3)的合成 根据文献[16]的方法进行。

1.2.2 目标化合物5 的合成 参考文献[13]的方法合成。将0.25 g 5-甲基异噁唑-4-甲酸 (2.0 mmol)、取代苯甲醛肟 (3，1.8 mmol)、0.41 g 二环己基碳二亚胺 (DCC，2.0 mmol) 加入50 mL 单口瓶中，然后加入20 mL 二氯甲烷作为溶剂，室温过夜搅拌。薄层色谱法 [V(乙酸乙酯) :V(石油醚) = 1 : 6]监测至反应结束。减压脱除溶剂，使用柱层析纯化 [V(乙酸乙酯) :V(石油醚) = 1 : 14]，干燥后即得目标化合物5。

化合物5 的熔点、1H NMR、13C NMR 和HRMS 数据如下：

O-(5-甲基异噁唑-4-甲酰基)-2-氟苯甲醛肟 (5a)：收率41%，白色固体，m.p.88.2～89.6 ℃。1H NMR (400 MHz,CDCl3)，δ：8.77 (s, 1H), 8.58 (s, 1H), 8.10～8.06 (m, 1H),7.54～7.48 (m, 1H), 7.24 (d,J= 7.6 Hz, 1H), 7.16 (d,J= 9.1 Hz,1H), 2.80 (s, 3H)。13C NMR (100 MHz, CDCl3)，δ：175.44,161.71 (d,1J= 254.4 Hz), 158.87, 150.61 (d,3J= 5.1 Hz),149.65, 133.86 (d,3J= 8.7 Hz), 127.82 (d,4J= 1.8 Hz), 124.75(d,3J= 3.6 Hz), 117.78 (d,2J= 10.2 Hz), 116.09 (d,2J= 20.8 Hz),107.50, 12.83。HRMS-ESI (m/z)：C12H9FN2NaO3[M + Na]+，计算值271.0489，测试值271.0489。

O-(5-甲基异噁唑-4-甲酰基)-3-氟苯甲醛肟 (5b)：收率45%，白色固体，m.p.89.9～91.6 ℃。1H NMR (400 MHz,CDCl3)，δ：8.56 (s, 1H), 8.47 (s, 1H), 7.57～7.52 (m, 2H),7.47～7.42 (m, 1H), 7.24～7.19 (m, 1H), 2.80 (s, 3H)。13C NMR(100 MHz, CDCl3)，δ：175.52, 162.88 (d,1J= 248.0 Hz),158.78, 155.72 (d,4J= 3.0 Hz), 149.57, 131.88 (d,3J= 8.0 Hz),130.68 (d,3J= 8.1 Hz), 124.64 (d,4J= 3.0 Hz), 119.09 (d,2J=21.4 Hz), 114.76 (d,2J= 23.1 Hz), 107.46, 12.81。HRMS-ESI(m/z)：C12H9FN2NaO3[M + Na]+，计算值271.0489，测试值271.0482。

O-(5-甲基异噁唑-4-甲酰基)-4-氟苯甲醛肟 (5c)：收率53%，白色固体，m.p.86.2～86.9 ℃。1H NMR (400 MHz,CDCl3)，δ：8.56 (s, 1H), 8.46 (s, 1H), 7.82～7.78 (m, 2H),7.19～7.13 (m, 2H), 2.79 (s, 3H)。13C NMR (100 MHz,CDCl3)，δ：175.38, 164.96 (d,1J= 253.6 Hz), 158.93,155.67, 149.59, 130.62 (d,3J= 8.9 Hz), 126.00 (d,4J= 3.3 Hz),116.34 (d,2J= 22.2 Hz), 107.55, 12.78。HRMS-ESI (m/z)：C12H9FN2NaO3[M + Na]+，计算值271.0489，测试值271.0483。

O-(5-甲基异噁唑-4-甲酰基)-2-氯苯甲醛肟 (5d)：收率67%，白色固体，m.p.115.9～117.1 ℃。1H NMR (400 MHz,CDCl3)，δ：8.93 (s, 1H), 8.59 (s, 1H), 8.14 (d,J= 7.5 Hz,1H), 7.46～7.44 (m, 2H), 7.37～7.33 (m, 1H), 2.81 (s, 3H)。13C NMR (100 MHz, CDCl3)，δ：175.55, 158.78, 155.43,149.57, 134.93, 131.75, 131.02, 130.51, 127.19, 123.17, 107.44,12.82。HRMS-ESI (m/z)：C12H9ClN2NaO3[M + Na]+，计算值287.0194，测试值287.0193。

O-(5-甲基异噁唑-4-甲酰基)-3-氯苯甲醛肟 (5e)：收率47%，白色固体，m.p.127.8～128.6 ℃。1H NMR (400 MHz,CDCl3)，δ：8.89 (s, 1H), 8.60 (s, 1H), 8.12 (dd,J= 7.5, 1.9 Hz, 1H), 7.64 (dd,J= 7.7, 1.1 Hz, 1H), 7.42～7.34 (m, 2H),2.81 (s, 3H)。13C NMR (100 MHz, CDCl3)，δ：175.53,158.87, 153.88, 149.63, 135.21, 132.97, 130.09, 128.48,127.73, 127.33, 107.47, 12.83。HRMS-ESI (m/z)：C12H9ClN2NaO3[M + Na]+，计算值287.0194，测试值287.0194。

O-(5-甲基异噁唑-4-甲酰基)-4-氯苯甲醛肟 (5f)：收率61%，白色固体，m.p.125.7～126.4 ℃。1H NMR (400 MHz,CDCl3)，δ：8.56 (s, 1H), 8.46 (s, 1H), 7.73 (d,J= 8.5 Hz,2H), 7.45 (d,J= 8.5 Hz, 2H), 2.79 (s, 3H)。13C NMR (100 MHz, CDCl3)，δ：175.45, 158.84, 155.69, 149.57, 138.20,129.66, 129.39, 128.25, 107.49, 12.80。HRMS-ESI (m/z)：C12H9ClN2NaO3[M + Na]+，计算值287.0194，测试值287.0207。

O-(5-甲基异噁唑-4-甲酰基)-2-溴苯甲醛肟 (5g)：收率59%，白色固体，m.p.111.4～113.1 ℃。1H NMR (400 MHz,CDCl3)，δ：8.56 (s, 1H), 8.45 (s, 1H), 7.82 (s, 1H), 7.65 (d,J= 7.6 Hz, 1H), 7.50～7.48 (m, 1H), 7.41 (t,J= 7.8 Hz, 1H),2.80 (s, 3H)。13C NMR (100 MHz, CDCl3)，δ：175.55,158.86, 156.15, 149.62, 133.35, 133.14, 129.34, 128.86,127.92, 125.05, 107.45, 12.83。HRMS-ESI (m/z)：C12H9BrN2NaO3[M + Na]+，计算值330.9689，测试值330.9700。

O-(5-甲基异噁唑-4-甲酰基)-4-溴苯甲醛肟 (5h)：收率73%，白色固体，m.p.129.4～130.9 ℃。1H NMR (400 MHz,CDCl3)，δ：8.56 (s, 1H), 8.46 (s, 1H), 7.73 (d,J= 8.5 Hz,2H), 7.45 (d,J= 8.5 Hz, 2H), 2.79 (s, 3H)。13C NMR (100 MHz, CDCl3)，δ：175.45, 158.84, 155.69, 149.57, 138.20,129.66, 129.39, 128.25, 107.49, 12.80。HRMS-ESI (m/z)：C12H9BrN2NaO3[M + Na]+，计算值330.9689，测试值330.9688。

O-(5-甲基异噁唑-4-甲酰基)-3-甲基苯甲醛肟 (5i)：收率50%，白色固体，m.p.85.1～85.9 ℃。1H NMR (400 MHz, CDCl3)，δ：8.57 (s, 1H), 8.45 (s, 1H), 7.66 (s, 1H),7.53 (d,J= 6.9 Hz, 1H), 7.37～7.31 (m, 2H), 2.79 (s, 3H), 2.40(s, 3H)。13C NMR (100 MHz, CDCl3)，δ：175.29, 159.05,157.04, 149.66, 138.89, 132.90, 129.61, 128.85, 128.61,126.10, 107.67, 21.22, 12.79。HRMS-ESI (m/z)：C13H12N2NaO3[M + Na]+，计算值267.0740，测试值267.0743。

O-(5-甲基异噁唑-4-甲酰基)-4-甲基苯甲醛肟 (5j)：收率63%，白色固体，m.p.92.2～94.1 ℃。1H NMR (400 MHz, CDCl3)，δ：8.56 (s, 1H), 8.45 (s, 1H), 7.68 (d,J= 8.2 Hz, 2H), 7.26 (d,J= 8.2 Hz, 2H), 2.75 (s, 3H), 2.41 (s, 3H)。13C NMR (100 MHz, CDCl3)，δ：175.21, 159.08, 156.88,149.67, 142.68, 129.73, 128.49, 126.93, 107.71, 21.66,12.78。HRMS-ESI (m/z)：C13H12N2NaO3[M + Na]+，计算值267.0740，测试值267.0737。

O-(5-甲基异噁唑-4-甲酰基)-4-三氟甲基苯甲醛肟(5k)：收率46%，白色固体，m.p.106.3～107.9 ℃。1H NMR (400 MHz, CDCl3)，δ：8.57～8.54 (m, 2H), 7.92 (d,J=8.1 Hz, 2H), 7.73 (d,J= 8.1 Hz, 2H), 2.81 (d,J= 0.6 Hz,3H)。13C NMR (100 MHz, CDCl3)，δ：175.65, 158.70,155.39, 149.52, 133.75 (q,2J= 34.6 Hz), 133.20, 128.74,125.99 (q,3J= 3.8 Hz), 123.57 (q,1J= 272.6 Hz), 107.35,12.81。HRMS-ESI (m/z)：C13H9F3N2NaO3[M + Na]+，计算值321.0457，测试值321.0456。

O-(5-甲基异噁唑-4-甲酰基)-4-异丙基苯甲醛肟 (5l)：收率46%，白色固体，m.p.91.4～92.7 ℃。1H NMR (400 MHz, CDCl3)，δ：8.56 (s, 1H), 8.46 (s, 1H), 7.71 (d,J= 8.3 Hz, 2H), 7.31 (d,J= 8.2 Hz, 2H), 2.96 (p,J= 6.9 Hz, 1H),2.79 (d,J= 0.7 Hz, 3H), 1.27 (d,J= 6.9 Hz, 6H)。13C NMR(100 MHz, CDCl3)，δ：174.18, 158.06, 155.84, 152.45,148.63, 127.60, 126.22, 126.10, 106.69, 33.21, 22.66, 11.74。HRMS-ESI (m/z)：C15H16N2NaO3[M + Na]+，计算值295.1053，测试值295.1048。

O-(5-甲基异噁唑-4-甲酰基)-3,4,5-三氟苯甲醛肟(5m)收率53%，白色固体，m.p.121.7～122.9 ℃。1H NMR(400 MHz, CDCl3)，δ：8.55 (d,J= 0.8 Hz, 1H), 8.39 (s, 1H),7.46 (dd,J= 7.5, 6.3 Hz, 2H), 2.80 (d,J= 0.7 Hz, 3H)。13C NMR (101 MHz, CDCl3)，δ：175.76, 158.49, 153.86 (dd,J= 5.3, 2.7 Hz), 151.60 (ddd,J= 252.6, 10.4, 3.9 Hz), 149.45,142.07 (dt,J= 259.0, 15.3 Hz), 125.90 (dt,J= 8.1, 4.9 Hz),112.69 (dd,J= 16.3, 6.5 Hz), 107.21, 12.81。HRMS-ESI(m/z)：C12H8F3N2NaO3[M + Na]+，计算值307.0301，测试值307.0291。

O-(5-甲基异噁唑-4-甲酰基)-2-氯-6-氟苯甲醛肟 (5n)：收率63%，白色固体，m.p.94.1～96 ℃。1H NMR (400 MHz, CDCl3)，δ：8.79 (s, 1H), 8.60 (s, 1H), 7.41 (td,J= 8.3 Hz, 1H), 7.34～7.19 (m, 1H), 7.20～7.04 (m, 1H), 2.80 (s,3H)。13C NMR (100 MHz, CDCl3)，δ：175.71, 161.31 (d,1J= 261.5 Hz), 158.60, 151.10 (d,3J= 3.2 Hz), 149.59, 135.76(d,3J= 4.0 Hz), 132.82 (d,3J= 10.0 Hz), 126.08 (d,4J= 3.7 Hz), 117.03 (d,2J= 14.3 Hz), 115.36 (d,2J= 21.9 Hz), 107.35,12.81。HRMS-ESI (m/z)：C12H8ClFN2NaO3[M + Na]+，计算值305.0100，测试值305.0097。

O-(5-甲基异噁唑-4-甲酰基)-3,5-二(三氟甲基) 苯甲醛肟 (5o)：收率77%，白色固体，m.p.145～146.7 ℃。1H NMR (400 MHz, CDCl3)，δ：8.60 (s, 1H), 8.57 (s, 1H),8.25 (d,J= 1.6 Hz, 2H), 8.02 (s, 1H), 2.81 (s, 3H)。13C NMR(101 MHz, CDCl3)，δ：175.91, 158.42, 154.02, 149.42,132.70 (q,2J= 34.1 Hz), 132.11, 128.23 (q,3J= 2.9 Hz),125.20 (sep,3J= 3.7 Hz), 122.75 (q,1J= 273.0 Hz), 107.10,12.78。HRMS-ESI (m/z)：C14H8F6N2NaO3[M + Na]+，计算值389.0331，测试值389.0327。

1.3 抑菌活性测试

采用菌丝生长速率法[17]测定目标化合物的抑菌活性。供试病原菌为小麦全蚀病菌Gaeumannomyces gramini、苹果树腐烂病菌Valsa mali、番茄灰霉病菌Botrytis cinerea和水稻纹枯病菌Rhizoctonia solani，由西北农林科技大学植物保护学院提供。以先导L1 和肟菌酯为对照药剂，初筛质量浓度为50 μg/mL。对初筛抑制率大于80%的化合物测定其EC50值[17]。

2 结果与讨论

2.1 目标化合物的合成及波谱分析

参考本课题组前期肟酯类化合物的合成方法，首先以取代苯甲醛 (1) 和盐酸羟胺 (2) 为原料，通过缩合反应合成肟类中间体3；然后在脱水缩合剂DCC 的存在下，中间体3 与5-甲基异噁唑-4-甲酸 (4) 进行反应得到目标化合物5。波谱分析以5g (图式3) 为例进行说明。1H NMR 中，在δ8.56 处的单峰为异噁唑环上1 个氢的信号峰；亚胺上1 个氢的信号在δ8.45 处，为单峰；苯环上氢的吸收峰δ在7.82～7.39；在δ2.80 处的甲基信号峰为单峰。13C NMR 中，在δ175.55 处为羰基碳的信号峰；在δ158.86 处为异噁唑环上5 位碳的信号峰；异噁唑环上3 位碳的信号峰在δ156.15。

图式 3 化合物5g 的化学结构式Scheme 3 Structural formula of compound 5g

2.2 抑菌活性

抑菌活性初筛结果 (表1) 表明，部分目标化合物在保留了先导化合物L1 对番茄灰霉病菌高活性的同时，还提高了对苹果树腐烂病菌的抑制活性[13]。化合物5d、5g 和5n 对番茄灰霉病菌表现出比先导化合物L1 和肟菌酯更优的活性，尤其化合物5g 和5n 对供试4 种植物病原菌均表现出中等至较好的抑制效果。对于苹果树腐烂病菌，化合物5i 和5n 与L1 相比抑菌活性有了显著提高，表明将5-甲基异噁唑-4-甲酸引入到肟酯结构中，有利于提高化合物的抑菌活性。初步构效关系分析表明，对于取代基位置，邻位取代的化合物表现出比间位和对位取代更好的活性 (5d ＞ 5e 和5f, 5g ＞5h)；双取代的化合物未能显著增加目标化合物的活性 (5k ＞ 5o)。

表1 目标化合物5a～5o 的离体抑菌活性 (50 μg/mL)Table 1 Antifungal activities in vitro of target compounds 5a-5o (50 μg/mL)

选取初筛抑制率大于80%的高活性化合物、L1 和肟菌酯测定其EC50值，结果见表2。化合物5g 对番茄灰霉病菌的EC50值为1.95 μg/mL，显著优于L1 和肟菌酯；对于苹果树腐烂病菌，化合物5i 和5n 表现出与L1 相似的活性，但不如肟菌酯。

表2 部分目标化合物对两种病原菌的EC50 值Table 2 EC50 values of some target compounds against two pathogenic fungi

3 结论

本研究设计合成了15 个新型5-甲基异噁唑-4-甲酸肟酯衍生物，并测定其对番茄灰霉病菌、水稻纹枯病菌、苹果树腐烂病菌和小麦全蚀病菌4 种植物病原菌的抑菌活性。结果表明，异噁唑环的引入对提高肟酯类化合物的抑菌活性是有利的。对于番茄灰霉病菌，化合物5g的EC50值为1.95 μg/mL，表现出比先导化合物L1更高的抑制活性，同时，也优于商品化药剂肟菌酯。5g可以作为创制新型杀菌活性化合物的先导进一步进行结构优化。